マウス卵母細胞における細胞質微小管組織化中心の多光子レーザーアブレーション

ここに記載されているすべての方法は、ミズーリ大学によって承認されています(アニマルケア品質保証参照番号9695)。 Cep192-eGFP レポーター6〜8週齢の雌マウスを本試験に用いた。 Cep192-eGFP レポーターマウスを作製するために、CRISPR/Cas9を介した相同性指向修復を用いて、EGFPレポーター遺伝子をCF-1マウスゲノムに組み込んだ。EGFPレポーターは、Cep192(MTOCの不可欠なコンポーネント)のC末端で融合しました15。マウスコロニーを維持するために、ホモ接合型の Cep192-eGfp レポーターマウスを使用した。すべての動物は、ケージ(ケージあたり最大4匹/ケージ)で21°C、湿度55%で維持され、12時間の明暗サイクルと食物と水への 自由 アクセスがありました。 1.マウス卵母細胞コレクション 培養培地(Chatot、Ziomek、およびBavister、CZB19、 材料表を参照)を調製し、37°Cおよび5%CO2 で一晩インキュベートします。注:CZB培地は4°Cで1ヶ月間保存できます(培地組成については 補足ファイル1 を参照)。 CZB培地にグルタミン(1 mM)とミルリノン(2.5 mM)(CZB + M)( 材料の表を参照)を補給し、インキュベーターに入れます。注:ミルリノンは、前期Iで停止した卵母細胞を維持し、減数分裂の再開を防ぐホスホジエステラーゼ阻害剤です20。 3 mg/mLのポリビニルピロリドン(PVP)、25 mM HEPES(pH 7.3)(補足ファイル1)、およびミルリノン(2.5 mM)(MEM/PVP + M、 材料表を参照)を含む収集培地(重炭酸塩を含まない最小必須培地、MEM)を準備します。 収集皿と培養皿を準備し、60 mmと35 mmのペトリ皿にそれぞれ4マイクロドロップ(100 μL)の収集培地(MEM/PVP + M)と2マイクロドロップ(100 μL)の培養液(CZB + M)を作り、鉱物油で覆います( 材料表を参照)。回収皿をスライド保温器上に保ち、培養皿を37°C、5%CO2のインキュベーターに入れる。 卵母細胞採取の44〜48時間前に、妊娠牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG、 材料の表を参照)の5IUを性的に成熟した(6〜8週齢) Cep192-eGFP レポーター雌マウスに腹腔内注射します。. マウスを頸部脱臼によって屠殺し、卵巣21を特定して除去し、37°Cで予熱した収集培地(MEM/PVP + M)を含む時計のグラスに移します。 時計のグラスの底に1 mLの注射器を触れ、束ねた縫い針を使用して数回(卵巣あたり~40回)穿刺して卵巣を固定し、卵母細胞を培地に放出します。 プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、ステップ1.7の積雲母細胞複合体(COC)を含むすべての培地を空の100 mmプラスチックペトリ皿に移します。 実体顕微鏡下で、パスツールガラスピペットを使用してCOCを収集し、MEM/PVP + Mを含む収集皿に移します。 細いパスツールガラスピペット(直径約100 μm)を使用して、穏やかに反復ピペッティングして卵母細胞を機械的に脱ヌードし、続いてCZB + M培養皿に移す前に、(100 μL)MEM/PVP + M(収集皿)の4マイクロドロップで卵母細胞を移して洗浄します。 露出した卵母細胞を空気中の5%のCO2 で37°Cで1時間インキュベートします。 2.卵母細胞マイクロインジェクション 250 μLのMEM/PVP + M滴を100 mmのプラスチック製ペトリ皿蓋に入れ、鉱物油で覆います。注意: ペトリ皿の蓋には、マイクロマニピュレーターを調整するためのより多くのスペースを提供する下部リムがあります。 マイクロインジェクションシステムをオンにします(材料の表を参照)。 マイクロインジェクションディッシュを顕微鏡の加温ステージ(37°C)に置きます。 マイクロローダーピペットチップ(材料の表を参照)を使用して、0.5 μLのmCh-Cep192cRNAを注射針にロードし、注射針をマイクロマニピュレーターに固定します。 露出した卵母細胞(ステップ1.11)を250 μLマイクロドロップ(ステップ2.1)に移します。 20倍または40倍の対物レンズの下で、卵母細胞の位置に応じて注射針と保持針の位置と焦点を調整します(図1)。 マイクロインジェクションユニットをセットアップし、注入圧力(pi)、補償圧力(pc)、および注入時間(ti)を設定して、5〜10 plの mCh-Cep192 cRNAを注入できるようにします(MTOCを外因的に標識するため)。 核に触れずに卵母細胞を慎重に注入します。 すべての卵母細胞を注入したら、CZB + Mの3マイクロドロップで洗浄し、培養皿(CZB + M)に移し、37°Cで3時間インキュベートしてmCh-Cep192を発現させます。 3.卵母細胞の成熟 空気中の5%CO2 をインキュベーター内で37°Cで少なくとも3時間予め平衡化したCZB培地にグルタミン(1mM)を添加して成熟培地を調製する。 35 mmのペトリ皿に成熟培地を2マイクロドロップ(100 μL)入れ、鉱物油(熟成皿)で覆います。 前期I-停止した卵母細胞を100 μLのミリノンフリーCZBマイクロドロップで少なくとも3回洗浄して、ミリノンを完全に除去し、減数分裂の再開を可能にします。 卵母細胞を成熟皿に移し、37°Cの空気中に5%CO2 を含む加湿インキュベーター内で5時間(前中期I期)インキュベートする。 4.アブレーションとイメージングのための卵母細胞の準備 前中期I卵母細胞(ステップ3.4)を、鉱物油で覆われた100 μLの成熟培地(ステップ3.1)を含むガラス底培養皿に移します。 5.アブレーションのための顕微鏡の準備 アブレーションの少なくとも30分前に、ステージインキュベーターの温度コントローラー( 材料表を参照)の電源を入れ、37°Cに設定します。 CO 2コントローラーの電源を入れ、5%CO2に設定します。 40倍の油浸アポクロマート対物レンズを選択し、液浸油を少量塗布します。 ガラス底培養皿を卵母細胞とともにステージトップインキュベーターに取り付け、インキュベーターをガス蓋で覆います。 画像取得ソフトウェア( 材料表を参照)で、複数のステージ位置の保存を可能にするオプションを選択します(例:「マークを定義して実験を見つける」)。透過光明視野照明を使用して、個々の卵母細胞を中心に置き、その位置を保存します。 画像取得ソフトウェアで、 XYZスキャン モードを選択し、画像形式を 256 x 256 ピクセルに設定し、ズーム係数を 2.5倍〜3.0倍に設定し、スキャン周波数を 600Hzに設定します。これは、約1.6μsのピクセル滞留時間に相当します。 488 nmの励起レーザーラインをレーザー出力の約10%(サンプルレベルで4.0 μWに相当)に設定し( 材料表を参照)、500〜550 nmのスペクトル帯域幅を使用してMTOCからのGFP信号を観測します。mCherryタグ付きCep192からの蛍光を同時に観察するには、585 nmの励起レーザーラインをレーザー出力の約8%(サンプルレベルで10.7 μWに相当)に設定し、595-645 nmのスペクトル帯域幅に設定された別の検出器を使用します。注:共焦点顕微鏡の透過光検出器(TLD)を使用して、卵母細胞の境界を同時に検出すると便利です。 ライブスキャンモードとzドライブの手動制御を使用して、卵母細胞のMTOCをスクリーニングします。 mcMTOC が検出されたら、その周りに正方形の関心領域 (ROI) を描画します。 6.MCMTOCのアブレーション フェムト秒レーザーを740nmの波長に設定します。注:レーザーの波長は、顕微鏡とレーザーの条件に応じて変更できます。 多光子顕微鏡の電気光学変調器( 材料表を参照)を使用して、サンプル面での70〜80mWの電力に対応するレーザー出力を60%〜70%に設定します。注意: レーザーにフェムト秒パルス補償器が装備されている場合は、それを使用して群遅延分散(GDD)を補正します。GDD補正は、効率的なmcMTOCアブレーションに必要なレーザー出力の量を減らし、卵母細胞への光損傷を最小限に抑えます。GDD制御は通常、市販の多光子顕微鏡の画像取得ソフトウェアと統合されています。 手順 5.6 と同じ画像形式、ズーム倍率、スキャン頻度を使用します。ライン平均化パラメーターとフレーム平均化パラメーターを 1 に設定します。 ソフトウェアのスキャンボタンをクリックして、選択したROIの単一の レーザースキャンを実行して 、mcMTOCのアブレーションを実行します。 ステップ5.7のチャンネル設定を使用して、多光子レーザー露光の前後に撮影されたGFP標識構造の画像を比較して、アブレーションの結果を確認します。アブレーションが成功すると、標的mcMTOCのGFP蛍光の強度はバックグラウンドで観察されるレベルまで低下します。 GFP標識構造の断片が残っている場合は、mcMTOCのさまざまなz平面に焦点を合わせて、手順6.4を1回以上繰り返します。 ステップ5.7のチャンネル設定を使用して、mcMTOC関連のmCherry信号(mCh-Cep192)の完全な損失によるアブレーション効率を確認します。 ステップ5.8からステップ6.7を繰り返して、卵母細胞のすべてのMTOCが(さまざまな焦点面で)アブレーションされるまで繰り返します。注:このプロトコルは、多光子レーザー露光後のmcMTOC枯渇を確認し、GFP蛍光の損失がGFP光退色によって引き起こされる可能性を排除する戦略として mCh-Cep192 マイクロインジェクションを使用します。ただし、このプローブのマイクロインジェクションはオプションであり、アブレーション手順には必要ありません。