Multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Universiteit van Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Nummer 9695). Cep192-eGFP reporter vrouwelijke muizen van 6-8 weken oud werden gebruikt in de huidige studie. Om Cep192-eGFP-reportermuizen te genereren, werd CRISPR / Cas9-gemedieerde homologie-gerichte reparatie gebruikt om het EGFP-reporter-gen in het CF-1-muizengenoom te integreren. De EGFP-verslaggever werd gefuseerd op het C-eindpunt van Cep192 (een integraal onderdeel van MTOCs)15. Om de muizenkolonie in stand te houden, werden homozygote Cep192-eGfp reportermuizen gebruikt. Alle dieren werden gehouden in kooien (maximaal vier dieren/kooien) bij 21 °C en 55% luchtvochtigheid, met een licht/donkercyclus van 12 uur en ad libitum toegang tot voedsel en water. 1. Verzameling van muizenocyten Bereid het kweekmedium (Chatot, Ziomek en Bavister, CZB19, zie de tabel met materialen) en incubeer het bij 37 °C en 5% CO2 ‘s nachts.OPMERKING: Het CZB-medium kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard (zie aanvullend dossier 1 voor de mediasamenstelling). Vul het CZB-medium aan met glutamine (1 mM) en milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (zie materiaaltabel) en plaats het in de incubator.OPMERKING: Milrinon is een fosfodiësteraseremmer die de eicellen in profase I in stand houdt en meiotische hervatting voorkomt20. Bereid het verzamelmedium (bicarbonaatvrij minimaal essentieel medium, MEM) met 3 mg/ml polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (aanvullend dossier 1) en milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, zie de materiaaltabel). Bereid de verzamel- en kweekschalen, maak vier microdruppels (100 μL) verzamelmedium (MEM/PVP + M) en twee microdruppels (100 μL) cultuurmedium (CZB + M) in respectievelijk 60 mm en 35 mm petrischalen en bedek ze met minerale olie (zie Materiaaltabel). Houd de opvangschaal op de schuifwarmer en zet de kweekschaal in de broedmachine bij 37 °C en 5% CO2. Injecteer intraperitoneaal 5 IE van serumgonadotrofine (PMSG, zie de tabel met materialen) in geslachtsrijpe (6-8 weken oude) Cep192-eGFP-verslaggever vrouwelijke muizen 44-48 uur vóór het verzamelen van eicellen. Offer de muizen op door cervicale dislocatie, identificeer en verwijder de eierstokken21 en breng ze over in een horlogeglas met voorbewarmd verzamelmedium (MEM / PVP + M) bij 37 ° C. Bevestig de eierstok door een spuit van 1 ml op de bodem van het horlogeglas aan te raken en deze meerdere keren (~ 40 keer per eierstok) te doorboren met behulp van naainaalden die bij elkaar zijn gebundeld om de eicellen in het medium vrij te maken. Breng met behulp van een plastic transferpipet al het medium met de cumulus-eicelcomplexen (COC’s) uit stap 1.7 over in een lege plastic petrischaal van 100 mm. Verzamel onder een stereomicroscoop de COC’s met behulp van een Pasteur-glazen pipet en breng ze over naar de verzamelschaal die MEM / PVP + M bevat. Gebruik een smalle Pasteur glazen pipet (ongeveer 100 μm in diameter) denud de eicellen mechanisch door voorzichtig repetitief pipetteren, gevolgd door ze over te brengen en te wassen in vier microdruppels van (100 μL) MEM / PVP + M (de verzamelschaal) voordat ze in de CZB + M-kweekschaal worden overgebracht. Incubeer de ontblote eicellen gedurende 1 uur bij 37 °C met 5% CO2 in de lucht. 2. Oöcyten micro-injectie Plaats een druppel MEM/PVP + M van 250 μL in een 100 mm plastic petrischaaldeksel en bedek het met minerale olie.OPMERKING: Het petrischaaldeksel heeft een onderste rand die meer ruimte biedt voor het aanpassen van de micromanipulator. Schakel het micro-injectiesysteem in (zie de tabel met materialen). Plaats de micro-injectieschaal op het opwarmingsstadium (37 °C) van de microscoop. Laad de injectienaald met 0,5 μL mCh-Cep192cRNA met behulp van pipetpunten van microladers (zie Materiaaltabel) en bevestig de injectienaald aan de micromanipulator. Breng de ontblote eicellen (stap 1.11) over naar de microdruppel van 250 μL (stap 2.1). Stel onder een lens van 20x of 40x de positie en de focus van de injectie- en houdnaalden aan op basis van de positie van de eicel (figuur 1). Stel de micro-injectie-eenheid in en stel de injectiedruk (pi), compensatiedruk (pc) en injectietijd (ti) in om 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA te kunnen injecteren (om de MTOCs exogene te labelen). Injecteer de eicellen voorzichtig zonder de kern aan te raken. Zodra alle eicellen zijn geïnjecteerd, wast u ze in drie microdruppels CZB + M, brengt u ze over naar de kweekschaal (CZB + M) en incubeert u ze gedurende 3 uur bij 37 °C om mCh-Cep192-expressie mogelijk te maken. 3. Rijping van eicellen Bereid het rijpingsmedium voor door glutamine (1 mM) toe te voegen aan CZB-medium dat vooraf in evenwicht is gebracht in een incubator met 5% CO2 in lucht bij 37 °C gedurende ten minste 3 uur. Maak twee microdruppels (100 μL) van het rijpingsmedium in een petrischaaltje van 35 mm en bedek ze met minerale olie (rijpingsschaal). Was profase I-arresteerde eicellen ten minste drie keer in 100 μL milrinonvrije CZB-microdruppels om het milrinon volledig te verwijderen en meiotische hervatting mogelijk te maken. Breng de eicellen over naar de rijpingsschaal en incubeer ze gedurende 5 uur (prometafase I-stadium) in een bevochtigde incubator met 5% CO2 in lucht bij 37 °C. 4. Oöcytenvoorbereiding voor ablatie en beeldvorming Breng de prometafase I-eicellen (stap 3.4) over naar een kweekschaal met glazen bodem die 100 μL rijpingsmedium (stap 3.1) bedekt met minerale olie bevat. 5. Microscoopvoorbereiding voor ablatie Schakel ten minste 30 minuten voor de ablatie de temperatuurregelaar voor de stage-incubator in (zie Materiaaltabel) en stel deze in op 37 °C. Schakel de CO2-controller in en stel deze in op 5% CO2. Selecteer een 40x olie-onderdompeling apochromatisch doel en breng een kleine druppel van de dompelolie aan. Monteer de kweekschaal met glazen bodem met de eicellen op een stage-top incubator en bedek de incubator met een gasdeksel. Selecteer in de software voor het verkrijgen van afbeeldingen (zie de tabel met materialen) een optie waarmee meerdere faseposities kunnen worden opgeslagen (bijvoorbeeld “Markering definiëren en experiment zoeken”). Met behulp van doorgelaten licht brightfield-verlichting, centreer je op de individuele eicellen en sla je hun posities op. Selecteer in de software voor het verkrijgen van afbeeldingen de XYZ-scanmodus , stel het beeldformaat in op 256 x 256 pixels, stel de zoomfactor in op 2,5x – 3,0x en selecteer een scanfrequentie van 600 Hz. Dit komt overeen met een pixel dwell time van ongeveer 1,6 μs. Stel een excitatielaserlijn van 488 nm in op ongeveer 10% van het laservermogen (wat overeenkomt met 4,0 μW op monsterniveau) (zie Tabel met materialen) en gebruik een spectrale bandbreedte van 500-550 nm om het GFP-signaal van de MTOCs te observeren. Voor de gelijktijdige waarneming van fluorescentie van de mCherry-gelabelde Cep192, stelt u een 585 nm excitatielaserlijn in op ongeveer 8% van het laservermogen (wat overeenkomt met 10,7 μW op monsterniveau) en gebruikt u een andere detector die is ingesteld op een spectrale bandbreedte van 595-645 nm.OPMERKING: Het is nuttig om de toegezonden lichtdetector (TLD) van de confocale microscoop te gebruiken voor het gelijktijdig detecteren van eicelgrenzen. Met behulp van een live scanmodus en de handmatige bediening van de z-drive, screent u de eicel op MTOCs. Zodra een mcMTOC is gedetecteerd, tekent u er een vierkant gebied van belang (ROI) omheen. 6. Ablatie van mcMC’s Stel een femtosecondelaser in op een golflengte van 740 nm.OPMERKING: De lasergolflengte kan worden gewijzigd volgens de microscoop en de lasercondities. Gebruik de elektro-optische modulator van de multi-fotonenmicroscoop (zie Tabel van materialen) om het laservermogen in te stellen op 70% -80%, wat overeenkomt met 60-70 mW vermogen op het monstervlak.OPMERKING: Als de laser is uitgerust met een femtoseconde pulscompensator, gebruik deze dan om te corrigeren voor groepsvertragingsdispersie (GDD). GDD-correctie vermindert de hoeveelheid laservermogen die nodig is voor efficiënte mcMTOC-ablatie en minimaliseert fotoschade aan de eicel. De GDD-besturing is meestal geïntegreerd met de beeldacquisitiesoftware van commerciële multi-fotonenmicroscopen. Gebruik dezelfde afbeeldingsindeling, zoomfactor en scanfrequentie als in stap 5.6. Stel de parameters voor lijn- en framegemiddelde in op 1. Klik op de knop Scannen in de software om de ablatie van de mcMTOC uit te voeren door een enkele laserscan van de geselecteerde ROI uit te voeren. Gebruik de kanaalinstellingen uit stap 5.7 om de resultaten van de ablatie te bekijken door de afbeeldingen van de GFP-gelabelde structuren te vergelijken die vóór en na de laserblootstelling met meerdere fotonen zijn gemaakt. Als de ablatie succesvol is, neemt de intensiteit van de GFP-fluorescentie in het beoogde mcMTOC af tot de niveaus die op de achtergrond worden waargenomen. Als er nog fragmenten van een GFP-labelstructuur overblijven, herhaalt u stap 6.4 een of meer keer door te focussen op verschillende z-vlakken van de mcMTOC. Gebruik de kanaalinstellingen uit stap 5.7 om de ablatie-efficiëntie te verifiëren door het volledige verlies van mcMTOC-geassocieerde mCherry-signalen (mCh-Cep192). Herhaal stap 5.8 tot stap 6.7 totdat alle MTCC’s van een eicel (op verschillende focale vlakken) zijn geableerd.OPMERKING: Dit protocol gebruikt mCh-Cep192 micro-injectie als een strategie om mcMTOC-uitputting na blootstelling aan multi-fotonenlaser te bevestigen en de mogelijkheid uit te sluiten dat het verlies van GFP-fluorescentie wordt veroorzaakt door GFP-fotobleaching. De micro-injectie van deze sonde is echter optioneel en niet vereist voor de ablatieprocedure.