벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

인간 췌장 관 선암 (PDAC) 환자 유래 오가노이드를 사용하였다. 조직 절제 단편은 앤트워프 대학 병원에서 치료 수술을받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자로부터 서면 사전 동의를 얻었으며 연구는 UZA 윤리위원회의 승인을 받았습니다(참조 14/47/480). 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어와 관련된 세부 정보는 재료 표에 나와 있습니다. 워크플로의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 예제 데이터는 프로토콜을 재현하기 위해 보충 자료에 제공됩니다. 1. 0일차: 생후 2일 또는 3일령 오가노이드의 제조 마이크로플레이트를 37°C에서 밤새 예열하고 4°C에서 세포외 매트릭스(ECM)를 해동합니다. 전체 PDAC 오가노이드 배양 배지 준비: 0.5nM WNT 대리모-Fc-융합 단백질, 4% Noggin-Fc 융합 단백질 조절 배지, 4% Rpso3-Fc 융합 단백질 조절 배지, 1x B27, 1mM N-아세틸 시스테인(NAC), 5mM 니코틴아미드, 500nM A83-01, 100ng/mL FGF10 및 10nM 가스트린으로 ADF+++(고급 DMEM/F12, 1% 글루타민 보충제, 1% HEPES 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 보충합니다. 선택 방법에 따라 PDTO를 설정합니다.참고 : 자세한 프로토콜은 Driehuis et al.에 의해 제공되며, ECM 돔4에서 PDTO를 설정, 배양 및 통과시키는 종래의 방법을 설명합니다. ECM 돔에서 유기체를 효소적으로 해리합니다.배지를 흡인하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 1x 세척합니다. 해리 효소(예: 6웰 마이크로플레이트에 2mL)를 추가하고 1mL 피펫으로 10배 위아래로 피펫하여 오가노이드와 ECM 돔을 기계적으로 해리합니다. 37°C에서 10분 동안 배양하고, 위아래로 피펫팅하고, 오가노이드가 단세포로 해리되는지 확인한다. 필요한 경우 이 단계를 반복합니다. 15mL 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 ADF+++를 10mL의 부피에 추가하고 실온에서 450× g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 파스퇴르 피펫과 흡입 펌프로 상청액을 흡입합니다. 펠릿의 크기에 따라 100-200 μL의 전체 배지에 펠릿을 재현탁하고 선택한 방법을 사용하여 세포 수를 계산합니다. 예: 세포 현탁액 10μL + 트리판 블루 10μL를 혼합하고 자동 세포 카운터로 계수합니다. ECM 돔에 단일 셀을 플레이트합니다.세포 현탁액을 희석하고 표 1에 따라 2/3 ECM을 첨가한다. 예열된 6웰 플레이트에서 웰당 최대 10개의 20μL 액적을 피펫팅합니다. 플레이트를 뒤집고 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 μM Y-27632가 보충 된 전체 배지로 오버레이하고 인큐베이터에서 2-3 일 동안 배양합니다.참고: 각각 75,000개의 세포를 포함하는 10개의 돔은 일반적으로 가장자리의 웰을 제외하고 200개의 오가노이드/웰 농도로 384웰 마이크로플레이트 1개를 채우기에 충분합니다. 2. 2-3일: 2일 또는 3일령 오가노이드 수확 및 파종 ECM 돔에서 손상되지 않은 유기체를 수집하십시오.참고: 오가노이드는 플라스틱 표면(예: 튜브, 피펫 팁)에 달라붙는 경향이 있습니다. 이를 방지하기 위해 플라스틱 제품은 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) / PBS 용액으로 미리 헹굴 수 있습니다.배지를 흡인하고 PBS로 1x 세척합니다. ECM 돔 수에 따라 6웰 플레이트에 1-2mL의 냉(4°C) 오가노이드 수확 용액을 추가하고 진탕 플랫폼의 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 1mL 피펫으로 위아래로 피펫하여 ECM 돔을 해리하고 얼음 위에서 10분 더 배양한 다음 ECM이 해리되었는지 현미경으로 육안으로 확인합니다. 선택 사항: 보다 균일한 크기 분포가 선호되는 경우 원심분리 전에 70μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 여과합니다. 0.1% BSA/PBS로 사전 코팅된 15mL 튜브에 오가노이드를 수집하고 최대 10mL까지 ADF+++를 추가하고 4°C에서 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 펠릿의 크기에 따라 최대 1,000μL의 전체 PDAC 오가노이드 배지에 펠릿을 재현탁하여 >6,000 오가노이드/mL의 농도를 얻습니다. 선택한 계수 방법, 바람직하게는 이미지 기반 방법을 사용하여 오가노이드를 계수하십시오. 유기체를 시드하십시오.참고: 이 프로토콜에 사용되는 두 가지 유형의 384웰 마이크로플레이트에 대한 최소 부피/웰에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.ECM의 응고를 방지하기 위해 사용하기 전에 모든 플라스틱 제품을 -20 ° C 또는 얼음에서 최소 20 분 동안 사전 냉각하십시오. 전체 배지를 사용하여 1mL의 오가노이드 원액(단계 2.1.6)에서 파종 용액을 준비하여 웰을 채우는 데 사용되는 최소 부피인 50μL의 웰당 ~200개의 오가노이드를 시드합니다. 보충 파일 1 을 사용하여 오가노이드 파종 용액의 양을 계산합니다. 25mL 저장소와 멀티채널 피펫 또는 피펫팅 로봇을 사용할 경우 1,500μL의 잔류 부피를 추가하십시오. 피펫팅 로봇을 사용하여 오가노이드를 시드합니다.참고: ECM의 응고를 방지하기 위해 피펫팅 중에 파종 용액과 마이크로플레이트 모두 4°C에서 냉각해야 합니다. 따라서 25mL 저장소와 마이크로플레이트 홀더를 3D 프린팅하여 재료 표에 나열된 냉각 요소를 담을 수 있는 피펫팅 로봇과 함께 사용했습니다. 맞춤형 실험기구(보충 파일 2 및 보충 파일 3)를 3D 프린팅하기 위한 STL 파일과 피펫팅 로봇을 위한 맞춤형 실험기구 JSON 파일(보충 파일 4 및 보충 파일 5)이 제공됩니다.온라인 프로토콜 디자이너 도구를 사용하여 분배 프로토콜을 설계합니다. 예제 JSON 파일(보충 파일 6)이 제공되며, 여기에는 맞춤형 실험기구가 이미 로드되어 있고 해당 파이펫 팁이 있는 8채널 p300(Gen2) 피펫이 사용됩니다. 피펫팅 로봇 제어 앱을 열고 프로토콜을 선택한 다음 가져오기를 클릭하고 보조 파일 6 을 지정된 필드로 끌어다 놓습니다. 가져온 프로토콜을 선택하고 냉각 요소와 플라스틱 제품을 포함한 모든 실험기구를 데크 설정 필드에 표시된 레이아웃에 따라 데크 에 배치합니다. 보충 파일 7에 표시된 대로 25mL 저장소 및 냉각 요소에 왼쪽 슬롯을 사용합니다. 프로토콜 실행을 클릭하고 설정을 진행합니다. 실험기구 설정 탭을 열고 실험기구 위치 확인 실행을 클릭한 다음 지침에 따라 피펫팅 로봇을 새 하드웨어에 맞게 교정합니다.참고: 실험기구 오프셋 데이터는 나중을 위해 저장할 수 있지만 각 실행 전에 실험기구 위치 검사를 실행하는 것이 좋습니다. 25mL 저장소(냉각 요소 상단에 위치)를 냉각된 오가노이드 파종 용액으로 채우고 실행 시작을 클릭합니다.참고: 상단 및 하단 웰도 8채널 피펫의 사용으로 인해 오가노이드 현탁액으로 채워집니다. 마이크로플레이트를 4°C에서 100 × g에서 1 분 동안 원심분리한다. 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다. 증발을 피하기 위해 외부 블랭크 웰을 최소 50μL의H2O로 채웁니다. 37°C에서 밤새 배양하여 이미지 분석을 방해할 수 있는 웰 내의 모든 기포를 제거한다. 3. 4일차: 디지털 약물 디스펜서를 사용한 약물 치료 및 시약 분주 디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어를 사용하여 약물 디스펜싱 프로토콜을 생성합니다.플레이트 레이아웃 위의 플레이트 1 위에 마우스를 놓고 플레이트 속성 편집을 선택하고 플레이트 유형: 384웰, 추가 볼륨(μL): 50 및 DMSO 제한(%): 1을 채웁니다. 유체 옆에 있는 + 버튼을 클릭하여 유체 를 추가합니다. 새로 생성 된 유체를 두 번 클릭하고 이름을 지정하십시오. 클래스 (DMSO 기반 또는 수성 + 트윈 20) 및 농도를 선택하십시오.알림: 모든 약물과 시약은 100% DMSO 또는 0.3% 트윈-20에 용해되어야 합니다. 최대 DMSO 농도 <1 %를 고려하여 1-10mM 스톡 용액을 사용할 수 있습니다. 표 2 는 일반적인 형광 시약 및 치료법에 필요한 희석액의 예를 제공합니다. 플레이트 레이아웃약물 적정의 경우, 웰을 선택하고 적정을 클릭하십시오. 유체의 경우, 관심 약물을 선택하고, 최고 농도 (예를 들어, 2,000 nM) 및 최저 농도 (예를 들어, 10 nM)를 선택하고; 반복실험의 경우 최소 2개를 선택하고 원하는 적정 패턴을 선택합니다.참고: 적정 패턴은 단일 플레이트에 얼마나 많은 화합물을 맞출 것인지, 웰을 무작위화할지 여부, 반복실험 및 대조군의 수를 포함한 많은 요인에 따라 달라집니다. 양성 대조군의 경우 3개의 웰을 선택하고 Set Value를 클릭한 다음 DMSO의 10mM 스톡에서 2μM 스타우로스포린을 채우면 최대 세포 사멸을 유도합니다. 사이토톡스 그린의 경우 사용된 모든 웰을 선택하고 설정 값을 클릭한 다음 60nM/웰을 입력합니다.참고: Cytotox Green 형광 염색은 죽은 세포를 나타내므로 약물 반응 모니터링을 방해하지 않습니다. 여기에서는 살아있는 세포에 대한 형광 마커가 필요하지 않습니다. 음성 대조군 및 DMSO 정규화의 경우, 비히클 제어를 위해 추가로 4개의 웰이 있는 모든 웰을 선택하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고, 정규화를 선택하고, 유체 클래스 정규화: DMSO 기반을 선택하고, 최고 클래스 부피로 정규화하여 각 웰에서 동일한 DMSO 농도를 얻습니다.알림: DMSO 농도는 <1%여야 합니다. 예시적인 TDD 약물 적정 파일(보충 파일 8)이 제공된다. 왼쪽 상단 모서리에 있는 실행 아래의 화살표를 클릭하고 항상 시뮬레이션을 선택한 다음 시뮬레이션을 클릭하여 오류를 식별하고 준비할 각 약물의 양을 얻습니다.알림: 초기 분주 용량이 너무 낮을 때 경고를 극복하려면 “각 플레이트의 각 유체에 대해 30nL 이상의 분주 경고 웰 권장”, 가장자리에서 물이 채워진 두 개의 웰을 선택하고 값 설정을 선택한 다음 경고가 발생하는 약물의 10μM 을 입력합니다. 이것은 약물 카트리지를 30nL보다 높은 부피로 프라이밍합니다. 이러한 동일한 웰을 사용하여 정규화를 총 부피 값의 %( 예: 0.5%)로 설정하여 DMSO 카트리지를 프라이밍할 수 있습니다. 선택 취소 항상 시뮬레이션 아래의 실행 단추; 실행을 클릭하여 약물 분배 프로토콜을 시작하고 지침을 따릅니다. 증발을 방지하기 위해 밀봉 멤브레인을 마이크로 플레이트에 적용하십시오. Cytotox Green 염료를 인큐베이터에서 37°C에서 1-2시간 동안 배양하고 4단계로 진행합니다. 4. 라이브 셀 이미저로 이미지 수집 알림: 성장률 및 NDR의 경우 Cytotox Green을 추가한 후 1-2시간 후에 시점 0(T0 = 치료 시작)에서 스캔을 받아야 합니다. 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어를 열고 메서드 편집기 새로 만들기를 선택한 다음 가져올 파일로 이동하여 예제 메서드 XML 파일(보조 파일 9)> 선택합니다. 또는 새 파일을 만들고 플레이트: (CORE384fb_OpticalImaging) – Corning 384 플랫 블랙(Corning #4588), 뚜껑 없음 및 습도 카세트 없음; 응용 프로그램: 이미지 전용; 목표: 4x; 패턴 : 중앙; 채널 확인 명시야 및 녹색(LED 강도(%) = 40; 노출 시간 (ms) = 200).알림: 녹색 채널 설정은 60nM 사이토톡스 그린 농도에서 잘 작동합니다. 라이브 뷰어 옵션을 사용하여 초점 오프셋 및/또는 LED 설정을 실시간으로 조정할 수 있습니다. 시작을 클릭하여 T0에서 스캔을 시작합니다. 동일한 방법을 사용하여 최대 5일 동안 24시간마다 스캔을 반복합니다. 또는 타임랩스 측정을 자동으로 실행하려면 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어에서 키네틱 루프 탭을 클릭하고 메서드 필드로 드래그하여 키네틱 실험으로 방법을 조정합니다. 마찬가지로, 온도 및 가스 탭을 방법 필드로 드래그하여 시스템을 37 ° C 및 5 % CO2로 설정하여 실험 중에 라이브 셀 이미 저 내에서 올바른 조건을 보장해야합니다. 5. 이미지 및 데이터 분석 데이터 병합 및 압축라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어는 각 시점에서 각 스캔에 대한 폴더를 생성합니다. 새 폴더를 만들고 개별 실험 폴더를 이 새 상위 폴더에 복사한 다음 _0h, _24h, _48h, _72h, _96h 및 _120h 해당 실험 폴더 이름에 추가합니다. 디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어에서 XLSX 플레이트 맵을 준비하고 약물 디스펜싱 프로토콜에서 플레이트 맵 레이아웃을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 모든 웰을 복사합니다. XLSX 파일에 데이터를 붙여넣습니다. Cytotox Green 및 스타우로스포린 데이터를 제거하고 세포주 및 복제를 위한 매트릭스를 추가합니다. Ctrl- 및 Ctrl+를 입력합니다. 예제 플레이트 맵에 대해서는 보충 파일 10 을 참조하십시오. 데이터 압축 도구를 열고 찾아보기를 클릭하고 상위 폴더를 선택한 다음 실행을 클릭하여 이미지 데이터 압축을 시작합니다. 서로 다른 타임 포인트에 대한 모든 TIFF 이미지 파일은 상위 폴더 내의 새 데이터 세트 폴더에있는 각 웰에 대해 단일 HDF5로 압축됩니다. 이미지 분석이미지 분석 웹앱 플랫폼으로 이동하여 로그인하고 홈 탭에서 새 프로젝트 추가를 클릭합니다. 프로젝트 이름을 입력하고, 계속하고, 새 실험 추가를 선택하고, HDF5 파일이 포함된 데이터 세트 폴더를 업로드합니다. 업로드 후 프로젝트 및 실험 폴더로 이동하여 플레이트맵 업로드 를 클릭하여 추가 기능을 확인합니다. 분석 실행을 클릭하고 다중 오가노이드 분석, 기본 파라미터를 선택한 다음 분석을 클릭하여 이미지 분석을 시작합니다. Download Results(결과 다운로드)를 클릭하여 각 웰에 대한 측정값(예: 총 명시야 영역, 총 형광 녹색 영역 등)이 포함된 원시 데이터 테이블과 분할된 이미지/비디오를 다운로드하여 분석 및 추가 데이터 처리의 정확성을 확인합니다. 성장률 기반 약물 반응 지표 및 정상화된 약물 반응결과 폴더(플레이트 맵 필요)(보조 파일 11)에서 Raw_NDR.xlsx 파일을 선택하고 Official_NDR_7point R-스크립트(보조 파일 12)에 로드하여 GR(ctrl-로 정규화됨) 및 NDR(ctrl- 및 ctrl+로 정규화됨) 값 테이블(보조 파일 13, 보조 파일 14, 보조 파일 15 및 보조 파일 16)을 자동으로 생성합니다. ). GR 및 NDR 값은 R-스크립트(보충 파일 12)를 사용하여 방정식 (1)과 같이 매개 변수에서 계산됩니다.총 생존 면적 = 총 명시야 면적 – 총 녹지 면적 (1)여기서 0은 NDR <1 = 세포 증식 억제 효과 (성장 정지), 및 NDR < 0 = 세포 독성 반응 (세포 사멸)을 <.참고 : R- 스크립트는 Gupta et al.6에서 채택되었습니다. clonal_data.xlsx 표에서 단일 오가노이드 반응 데이터를 가져와 버블 플롯으로 플로팅합니다. Z-인자10 을 사용하여 실행의 약물 스크리닝 품질을 평가합니다(방정식 (2) 참조). Z 계수가 0.5< 실험은 폐기합니다.(2)