Aquí, presentamos un protocolo para la selección in vitro de represores transcripcionales (ETR) diseñados con una alta eficiencia de silenciamiento estable, estable y a largo plazo y una baja actividad fuera del objetivo en todo el genoma. Este flujo de trabajo permite reducir un repertorio inicial y complejo de ETR candidatos a una lista corta, adecuada para una evaluación posterior en entornos terapéuticamente relevantes.
La inactivación génica es fundamental para estudiar la función de los genes y representa una estrategia prometedora para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. Entre las tecnologías tradicionales, la interferencia de ARN sufre la abrogación parcial de la diana y la necesidad de tratamientos de por vida. Por el contrario, las nucleasas artificiales pueden imponer una inactivación génica estable a través de la inducción de una rotura de doble cadena de ADN (DSB), pero estudios recientes cuestionan la seguridad de este enfoque. La edición epigenética dirigida a través de represores transcripcionales (ETR) diseñados puede representar una solución, ya que una sola administración de combinaciones específicas de ETR puede conducir a un silenciamiento duradero sin inducir roturas de ADN.
Las ETR son proteínas que contienen un dominio de unión al ADN (DBD) programable y efectores de represores transcripcionales naturales. Específicamente, se demostró que una combinación de tres ETR equipadas con el dominio KRAB de ZNF10 humano, el dominio catalítico de DNMT3A humano y DNMT3L humano, induce estados epigenéticos represivos hereditarios en el gen ETR-diana. La naturaleza de atropello y fuga de esta plataforma, la falta de impacto en la secuencia de ADN del objetivo y la posibilidad de volver al estado represivo mediante la desmetilación del ADN a pedido, hacen que el silenciamiento epigenético sea una herramienta que cambia las reglas del juego. Un paso crítico es la identificación de la posición adecuada de los ETR en el gen diana para maximizar el silenciamiento en el objetivo y minimizar el silenciamiento fuera del objetivo. Realizar este paso en el entorno preclínico final ex vivo o in vivo puede ser engorroso.
Tomando el sistema CRISPR/Cas9 catalíticamente muerto como un DBD paradigmático para ETRs, este artículo describe un protocolo que consiste en el cribado in vitro de ARNs guía (ARNg) acoplado a la combinación de triple ETR para un silenciamiento eficiente en el objetivo, seguido de la evaluación del perfil de especificidad de todo el genoma de los principales aciertos. Esto permite reducir el repertorio inicial de ARNg candidatos a una lista corta de prometedores, cuya complejidad es adecuada para su evaluación final en el entorno de interés terapéuticamente relevante.
La inactivación génica ha desempeñado tradicionalmente un papel clave en el estudio de la función génica tanto en modelos celulares como animales. Además, en las últimas dos décadas, con el auge de la terapia génica, se ha propuesto como un enfoque potencialmente revolucionario para tratar enfermedades causadas por mutaciones de ganancia de función1, enfermedades infecciosas2 o patologías en las que el silenciamiento de un gen puede compensar un defecto hereditario en otro3. Por último, se ha propuesto la inactivación genética de reguladores clave de la aptitud celular y el control funcional para mejorar la eficiencia de los productos celulares para la inmunoterapia contra el cáncer4 y la medicina regenerativa5.
Entre las diferentes tecnologías para lograr la inactivación génica, una de las más prometedoras es el silenciamiento epigenético dirigido 6,7. En el núcleo de esta tecnología se encuentran los llamados represores transcripcionales de ingeniería (ETR), proteínas quiméricas que consisten en un dominio de unión al ADN (DBD) programable y un dominio efector (ED) con función represiva epigenética. Las proteínas dedo de zinc (ZFP)8, los efectores similares a los activadores de transcripción (TALE)9 o los DBD basados en CRISPR/dCas910 pueden diseñarse para vincular selectivamente la DE a la secuencia promotora/potenciadora del gen diana que se va a silenciar. Una vez allí, el DE de la ETR realiza su actividad silenciadora mediante la imposición de marcas epigenéticas represivas inductoras de heterocromatina como las modificaciones de histonas (metilación H3K9 11,12 o H3K27 13, desacetilación H3 o H4 14) y la metilación del ADN CpG 15, según el dominio represivo utilizado.
En particular, inspirándose en los procesos moleculares de represión transcripcional permanente de retrovirus endógenos que ocurren en el embrión preimplantacional16, se ha generado una combinación de tres ETR para explotar los siguientes DE: i) el dominio de la caja asociada a Krüppel (KRAB) del ZNF10 humano; ii) el dominio catalítico de la ADN metiltransferasa 3A humana de novo (DNMT3A); y iii) la metiltransferasa 3-similar a la ADN humana de longitud completa (DNMT3L). KRAB es un dominio represivo conservado compartido por varias ZFP en vertebrados superiores17,18, cuya actividad silenciadora se basa principalmente en su capacidad para reclutar KAP1 19-una proteína de andamio que luego interactúa con varios otros inductores de heterocromatina20 que comprenden el complejo de remodelación y desacetilación de nucleosomas (NuRD) 21, la histona metiltransferasa H3K9 SETDB122 y el lector de metilación H3K9 HP1 23, 24, entre otros.
DNMT3A transfiere activamente grupos metilo en el ADN en las secuencias CpG25. La actividad catalítica de DNMT3A se ve reforzada por su asociación física con DNMT3L, un parálogo de DNMT3A restringido a embriones y células germinales que carece del dominio catalítico responsable de la transferencia del grupo metilo26,27. La metilación del ADN en las regiones ricas en CpG, denominadas islas CpG (CGI), incrustadas en los elementos promotores/potenciadores de los genes de los mamíferos, generalmente se asocia con el silenciamiento de la transcripción28. Es importante destacar que, una vez depositada, la metilación de CpG puede heredarse de manera estable a lo largo de la mitosis mediante un complejo molecular basado en UHRF1-DNMT129.
La sobreexpresión estable de las ETR en la célula diana puede ser problemática, probablemente debido a los crecientes riesgos de actividad fuera de la diana y a la supresión de los interactores endógenos de sus sitios diana fisiológicos a lo largo del tiempo. Sin embargo, la expresión transitoria de fracciones de una sola ETR puede no inducir el silenciamiento a largo plazo con alta eficiencia30, lo que dificulta su aplicación terapéutica. Por lo tanto, un avance seminal en el campo fue la evidencia de que la combinación de los tres ETR basados en KRAB, DNMT3A y DNMT3L puede sinergizar e, incluso cuando solo se administra de forma transitoria, imponer a la secuencia promotora del gen diana H3K9 y la metilación de CpG. A continuación, la célula los lee y propaga a lo largo de la mitosis, lo que conduce a un silenciamiento hereditario en múltiples líneas celulares humanas y murinas, así como en células primarias cultivadas ex vivo 30.
Cabe destacar que el silenciamiento epigenético impuesto por los ETR puede revertirse a demanda mediante la desmetilación del ADN30 dirigida (por ejemplo, el reclutamiento de la ADN desmetilasa TET1 basada en CRISPR/dCas9 en el locus silenciado) o farmacológica (administración del inhibidor de la metiltransferasa 5-Aza) del ADN, un antídoto potencial en caso de eventos adversos relacionados con ETR. También se describieron ETRs todo en uno que llevan los tres DE basados en KRAB, DNMT3A y DNMT3L, mostrando eficiencias de silenciamiento significativas en las líneas celulares31,32 contra la gran mayoría de los genes codificadores de proteínas. Además, varios estudios que emplearon los ETR reportaron un alto perfil de seguridad, sin actividad significativa fuera del objetivo en términos de metilación de novo de CpG o alteración de la accesibilidad de la cromatina30,31,32. Sin embargo, se recomienda un análisis específico del perfil de especificidad de los ETR equipados con un DBD de nuevo diseño antes de las aplicaciones clínicas.
Desde una perspectiva clínica, el silenciamiento epigenético dirigido puede proporcionar ventajas críticas tanto para el knockdown basado en ARN de interferencia (ARNi)33 como para la disrupción génica artificial basada en nucleasas8. A diferencia del ARNi, el silenciamiento epigenético dirigido puede inducir la abrogación completa de su diana por célula y no requiere tratamiento periódico para garantizar el silenciamiento a largo plazo; a diferencia de la disrupción génica, deja la secuencia de ADN inalterada, evitando la generación de roturas de doble cadena de ADN (DSB). Los DSB pueden entonces inducir la apoptosis y la detención del ciclo celular, lo que podría conducir a una selección contra células con una vía p53 funcional 34,35 y, especialmente en entornos de edición de genes multiplex, reordenamientos cromosómicos35. Además, al transmitir el resultado irreversible en mosaico de la reparación DSB36 del ADN mediada por la unión de extremos no homólogos, la disrupción génica no puede evitar la reparación en el marco de la diana en secuencias codificantes funcionales como uno de los resultados finales y, a diferencia del silenciamiento epigenético, no puede borrarse a demanda.
Por último, el silenciamiento epigenético tiene el potencial de ampliar la gama de elementos genéticos diana a clases total o al menos parcialmente refractarias al ARNi y a la disrupción génica, como los elementos reguladores no transcritos y los ARN no codificantes30,32. El primer paso crítico para cualquier aplicación de silenciamiento epigenético dirigido es diseñar un panel de ETRs que cubra las diferentes secuencias reguladoras del gen diana e identificar las de mejor rendimiento. El número de ETR que se van a probar puede ser crucial, teniendo en cuenta la creciente porción del genoma que puede ser objeto de las tecnologías programables de unión al ADN en constante desarrollo37. Realizar el cribado de las ETRs directamente sobre el tipo celular en el que silenciar terapéuticamente el gen diana representaría la opción más relevante. Sin embargo, los cribados de alto rendimiento pueden ser técnicamente engorrosos en las células primarias debido a su supervivencia limitada en cultivo y a su capacidad de ingeniería, a menudo subóptima. Las pantallas a gran escala pueden ser aún más inviables in vivo.
Una alternativa más práctica consiste en realizar un cribado inicial de un gran panel de ETRs en líneas celulares fácilmente modificables al principio, y luego validar solo las más prometedoras en el tipo de célula terapéuticamente relevante. Un problema paralelo es la selección de una lectura apropiada para medir la eficiencia de silenciamiento de los ETR. La evaluación directa de la transcripción o de los niveles de proteínas del gen diana mediante RT-qPCR, Western blot o ELISA puede ser costosa y llevar mucho tiempo, y puede carecer de suficiente sensibilidad, lo que limita su aplicación a escalas de alto rendimiento. La generación de líneas celulares reporteras de ingeniería ad hoc en las que un fluoróforo se coloca bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras del gen diana permite la explotación del enfoque basado en citometría de flujo para leer el silenciamiento epigenético a nivel de una sola célula y a un ritmo de alto rendimiento.
Siguiendo estas consideraciones generales, este artículo describe un protocolo que consiste en el cribado in vitro de ETRs para la eficiencia del silenciamiento en el objetivo, seguido de la evaluación de la actividad fuera del objetivo en todo el genoma de los principales aciertos. Este flujo de trabajo permite reducir el repertorio inicial de ETRs candidatas a una lista corta de prometedoras, cuya complejidad es adecuada para su evaluación final en el tipo de célula terapéuticamente relevante de interés.
Entre los diferentes DBDs programables que pueden ser explotados para generar ETRs, este protocolo se centrará en la tecnología basada en CRISPR/dCas9, debido a la facilidad de diseñar gRNAs que abarcan el promotor del gen diana a una escala de alto rendimiento. Sin embargo, se puede adoptar el mismo flujo de trabajo conceptual que se describe a continuación para evaluar la eficiencia y la especificidad de los ETR equipados con otros DBD.
El silenciamiento epigenético dirigido puede representar una solución prometedora para tratar trastornos que pueden beneficiarse de la inactivación permanente de genes, incluidas las enfermedades causadas por mutaciones de ganancia de función1, las enfermedades infecciosas2 y las patologías en las que el silenciamiento de un gen puede compensar un defecto hereditario en otro3 o liberar todo el potencial de las terapias celulares adoptivas4. 5. Al actuar a nivel de la cromatina y ser autopropagado por la célula 7,30,32, el silenciamiento epigenético puede evitar alteraciones tóxicas (por ejemplo, reordenamientos cromosómicos) de la secuencia de ADN del gen diana y el silenciamiento parcial y transitorio de la diana, que son limitaciones de la disrupción génica artificial basada en nucleasas8,34,35 y la knockdown basada en ARNi 33, respectivamente.
Uno de los pasos preliminares clave en cualquier protocolo de silenciamiento epigenético es identificar la posición adecuada en el gen diana para dirigir los ETRs que depositarán las marcas epigenéticas represivas necesarias para desactivar la actividad transcripcional de la diana. Diferentes elementos reguladores del sitio de inicio transcripcional, proximal y distal pueden concurrir para apoyar la salida transcripcional de un gen humano dado54. Además, ahora se pueden identificar diferentes sitios diana por elemento regulador específico gracias al creciente número de tecnologías programables de unión al ADN6. Por lo tanto, los protocolos, como el que se describe aquí en líneas celulares modificadas, se pueden utilizar para nominar sitios diana individuales y/o regiones genómicas susceptibles de silenciamiento epigenético mediado por ETR, antes de embarcarse en esfuerzos de evaluación engorrosos y lentos de los mejores candidatos en el entorno terapéutico final. A continuación se describen algunos aspectos críticos del protocolo.
Ingeniería de una línea celular reportera predictiva de la diana terapéutica final
A pesar de la constante optimización de los protocolos de ingeniería celular, necesarios aquí para insertar el casete que codifica el indicador fluorescente en el gen diana y para administrar los ETR, no se puede dar por sentado que ya estén disponibles para la línea celular que más se parezca a la diana terapéutica final. En este caso, se pueden aplicar diferentes estrategias de mitigación: a) aprovechar los kits de optimización proporcionados por los proveedores para optimizar internamente el protocolo de transfección para la línea celular objetivo; b) cambiar a otras líneas celulares que aún expresan ese gen diana, pero que pertenecen a tejidos distintos de la diana terapéutica final, para lo cual se han optimizado ampliamente los protocolos de ingeniería. En caso de que estas opciones no estén disponibles, se puede considerar cambiar a tipos de células primarias u organoides que representen el objetivo final. Como consideración general tanto para los estudios preclínicos como para las aplicaciones terapéuticas del silenciamiento epigenético basado en ETR, se deben descartar los escenarios en los que el gen diana es esencial para el tipo de célula diana. El silenciamiento completo y a largo plazo de un gen esencial impuesto por las ETR conducirá a la contraselección de las células diana a lo largo del tiempo (y, potencialmente, a la toxicidad del tratamiento). En estos casos, se prefieren las tecnologías alternativas que proporcionan la abrogación parcial de la diana, como el ARNi33.
Evaluación de la actividad de silenciamiento en blanco de los ETR
Las ETR basadas en la combinación de dominios efectores KRAB, DNMT3A y DNMT3L han demostrado ser eficaces contra la gran mayoría de los genes codificadores de proteínas, con una ventana de orientación permisiva de 1 kilobase centrada en el sitio de inicio de la transcripción32. Para tener una idea de cómo se ve un experimento de silenciamiento epigenético bien realizado, aquí se proporcionan los detalles técnicos y los resultados del silenciamiento del gen B2M en las células K-562. Esto puede considerarse un control positivo importante que debe incluirse no solo por los investigadores que trabajan con células K-562, sino también por aquellos que se acercan a la tecnología basada en ETR por primera vez. Como se indica en el protocolo, se recomienda la disrupción génica basada en nucleasas artificiales (por ejemplo, CRISPR/Cas9) como un control adicional tanto de la eficiencia de la entrega de genes en el tipo de célula de interés como del fenotipo de células privadas del gen diana. Después de la selección inicial de los ARNg que se acoplarán con los ETR basados en CRISPR/dCas9, si ninguno de los ARNg probados es capaz de silenciar permanentemente el gen diana, se debe considerar, en el siguiente orden: 1) aumentar la cantidad de ARNg y ETR entregados; 2) grupos de pruebas de los principales ARNg en busca de efectos sinérgicos entre ellos. Si aún no se logra el silenciamiento a largo plazo, se debe considerar: 3) probar ARNg adicionales, que pueden dirigirse a sitios más relevantes para instruir el silenciamiento epigenético; 4) cambiar a plataformas DBD basadas en ZFP8 o TALE9, que pueden tener una capacidad de unión mejorada a la cromatina objetivo; 5) cambiar de transitorio a estable, por ejemplo, integrando la expresión basada en vectores virales de los ETR (ya sea el ARNg o las construcciones de fusión dCas9 o ambas cuando se adopta la tecnología CRISPR/dCas9). Dado que nuestro grupo desarrolló, y tiene una sólida experiencia con, la entrega conjunta de los tres ETR30 separados, el protocolo y los resultados que se muestran aquí se basan en este enfoque. Sin embargo, es probable que se pueda aplicar un flujo de trabajo conceptual similar para un sistema todo en uno basado en CRISPR32.
Evaluación de la actividad fuera del objetivo de los ETR
Múltiples estudios han mostrado indicaciones preliminares in vitro de la especificidad de las ETR basadas en la combinación de los dominios efectores KRAB, DNMT3A y DNMT3L30,31,32. Sin embargo, si entre los ARNg analizados, ninguno de ellos muestra un perfil de especificidad satisfactorio en términos de regulación transcripcional y/o metilación de novo del ADN, se pueden seguir dos estrategias no mutuamente excluyentes: a) reducir el tiempo de residencia de los ETR dentro de la célula (y, en consecuencia, su posible actividad fuera del objetivo) disminuyendo las dosis de ETR o probando sistemas de administración alternativos. Por ejemplo, en comparación con los plásmidos, se espera que tanto el ARNm como la administración de proteínas reduzcan el tiempo de exposición celular a los ETR y, en consecuencia, la probabilidad de actividad fuera del objetivo55; b) cambiar a variantes más recientes de Cas9, optimizadas para reducir la unión fuera del objetivo de la plataforma56, o a tecnologías alternativas de unión al ADN basadas en ZFP8 o TALE9. Es importante tener en cuenta que, en comparación con las muestras tratadas simuladamente, la actividad del silenciamiento génico en la diana y fuera de la diana se ve afectada no sólo por la unión de la DBD a su secuencia diana, sino también por la capacidad potencial de los dominios efectores epigenéticos para ser reclutados a otros loci por sus cofactores endógenos naturales. Por lo tanto, la reducción del tiempo de residencia de las ETR en la célula diana puede disminuir no solo la probabilidad de unión de la DBD a sitios fuera de la diana, sino también la probabilidad de que las ETR interactúen con cofactores endógenos, con posibles ventajas en términos de especificidad y desventajas en términos de actividad en la diana. Por último, en comparación con las muestras tratadas con simulacro, algunas de las alteraciones de la metilación transcripcional y, menos probables, de CpG medidas en las células silenciadas pueden derivarse simplemente de la privación del gen diana. Estos no se consideran fuera de los objetivos de la tecnología de silenciamiento. Para identificarlos, también se debe incluir la disrupción génica por nucleasa artificial en el panel experimental 8,9,10. Las alteraciones biológicas debidas a la pérdida funcional del gen diana serán compartidas entre el silenciamiento epigenético y esta tecnología alternativa.
The authors have nothing to disclose.
Los autores quieren agradecer a Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica y Deborah Cipria por el esfuerzo colaborativo en el desarrollo de la tecnología de silenciamiento epigenético a lo largo de los años; Dejan Lazarevic y Francesca Giannese por la revisión crítica de los análisis RNA-seq y MeDIP-seq descritos en el protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones a A.L. de la Fundación Teletón (beca TIGET nº F1) y del Programa Horizonte 2020 de la UE (UPGRADE). Las ilustraciones han sido creadas con BioRender.com.
CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES
A.M, M.A.C., F.G. y A.C. contribuyeron al diseño del protocolo y a la redacción del manuscrito; S.V., I.M. y D.C. diseñaron las secciones de bioinformática del protocolo y revisaron el manuscrito; A.M. y A.L. diseñaron el protocolo, concibieron y escribieron el manuscrito con el aporte de todos los autores.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |