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Abstract
Introduction
Protocol
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Discussion
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Acknowledgements
Materials
Referências
Imunologia e Infecção

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Abstract

Este protocolo visa estabelecer um método para identificar pequenos antagonistas moleculares da ativação de integrinas β2, utilizando anticorpos notificadores de mudança conformacional e citometria de fluxo de alto rendimento. O método também pode servir como um guia para outros métodos de triagem de alto rendimento baseados em anticorpos. As integrinas β2 são moléculas de adesão leucocitárias específicas que são cruciais na resposta imune. Os neutrófilos dependem da ativação da integrina para sair da corrente sanguínea, não apenas para combater infecções, mas também para estar envolvidos em múltiplas doenças inflamatórias. O controle da ativação das integrinas β2 apresenta uma abordagem viável para o tratamento de doenças inflamatórias associadas a neutrófilos. Nesse protocolo, um anticorpo monoclonal, mAb24, que se liga especificamente ao headpiece de alta afinidade das integrinas β2, é utilizado para quantificar a ativação da integrina β2 em neutrófilos humanos primários isolados. N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) é usado como um estímulo para ativar integrinas β2 neutrófilos. Um citômetro de fluxo de alto rendimento capaz de executar automaticamente amostras de placas de 384 poços foi usado neste estudo. Os efeitos de 320 produtos químicos na inibição da integrina β2 são avaliados dentro de 3 h. Moléculas que têm como alvo direto integrinas β2 ou moléculas-alvo na via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina iniciada pelo receptor acoplado à proteína G podem ser identificadas através desta abordagem.

Introduction

Muitas doenças inflamatórias são caracterizadas pela infiltração de neutrófilos no local do edema ou lesão1. Para infiltração desses tecidos, os neutrófilos devem completar a cascata de recrutamento de neutrófilos, que envolve parada no endotélio, extravasamento através da parede do vaso e recrutamento para o tecido2. Os neutrófilos circulantes necessitam da ativação da integrina β2 para completar essa cascata, especialmente para a fase de parada. Assim, drogas inibidoras de integrinas que reduzem a adesão, o extravasamento e o recrutamento de neutrófilos podem efetivamente tratar doenças inflamatórias 3,4.

As integrinas β2 já foram alvo de doenças inflamatórias anteriormente. O efalizumabe, um anticorpo monoclonal que tem como alvo direto a integrina αLβ2, foi desenvolvido para o tratamento da psoríase5. Entretanto, o efalizumabe foi suspenso devido ao seu efeito colateral letal – leucoencefalopatia multifocal progressiva resultante da reativação do vírus JC 6,7. Novas terapias anti-inflamatórias baseadas em integrinas devem considerar a manutenção das funções anti-infecciosas dos leucócitos para minimizar os efeitos colaterais. Os efeitos colaterais do efalizumabe podem ser devidos à circulação prolongada de anticorpos monoclonais na corrente sanguínea, o que poderia inibir as funções imunes em longo prazo8. Um estudo recente mostra que o efalizumabe medeia ligações cruzadas αLβ2 e a internalização indesejada de integrinas α4, fornecendo uma explicação alternativa para os efeitos colaterais9. Assim, antagonistas de pequenas moléculas de curta duração poderiam evitar esse problema.

Um método de alto rendimento para triagem de antagonistas de integrinas β2 de pequenas moléculas usando neutrófilos humanos é apresentado aqui. A ativação da integrina β2 requer mudanças conformacionais do ectodomínio da integrina para obter acesso e aumentar sua afinidade de ligação ao seu ligante. No modelo canônico de switchblade, o ectodomínio de integrina dobrado-fechado primeiro se estende a uma conformação estendida-fechada e, em seguida, abre seu cabeçote para uma conformação estendida-aberta totalmente ativada10,11,12,13. Há também uma via alternativa que parte do dobrado-fechado para o dobrado-aberto e estendido-aberto, eventualmente 14,15,16,17,18,19. O anticorpo conformação-específico mAb24 liga-se a um epítopo no domínio β2-I-like humano quando a cabeça do ectodomínio está aberta20,21,22,23.

Aqui, mAb24-APC é usado para determinar se as integrinas β2 estão ativadas. Para ativar neutrófilos e integrinas, N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), um peptídeo quimiotático curto derivado de bactérias que pode ativar integrinas β2 de neutrófilos24, é usado como estímulo nesse protocolo. Quando fMLP se liga ao Fpr1 em neutrófilos, cascatas de sinalização a jusante envolvendo proteínas G, fosfolipase Cβ e γ de fosfoinositida 3-quinase são ativadas. Esses eventos de sinalização acabam resultando na ativação da integrina através da via de sinalização de dentro para fora18,25. Além de antagonistas de pequenas moléculas que se ligam diretamente às integrinas β2 e impedem mudanças conformacionais da ativação da integrina26, compostos que podem inibir componentes da via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina β2 também seriam detectados com este método. Os citômetros de fluxo automatizados permitem a triagem de alto rendimento. A identificação de novos antagonistas pode não apenas aprofundar nossa compreensão da fisiologia das integrinas, mas também fornecer informações translacionais sobre a terapia anti-inflamatória baseada em integrina.

Protocol

Amostras de sangue total heparinizadas foram obtidas de doadores humanos saudáveis não identificados após a obtenção do consentimento informado, conforme aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UConn Health, seguindo os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os doadores assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os critérios de inclusão/exclusão deste estudo foram cuidadosamente desenvolvidos para garantir a adequação dos participantes e minimizar potenciais riscos. Os participantes…

Representative Results

Dados de uma triagem representativa de placas de 384 poços (Figura 4) revelaram que os controles negativos tinham uma MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, enquanto os controles positivos tinham uma MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. O fator Z’ para esta placa é de aproximadamente 0,33, que está dentro de uma faixa aceitável31. No entanto, Z’ requer validação adicional em ensaios secundários. Para normalizar os dados, todos os valores foram…

Discussion

O início e o término da estimulação e coloração de neutrófilos são determinados pela adição de neutrófilos e do PFA fixador. Portanto, garantir o mesmo intervalo de tempo entre a pipetagem de neutrófilos ou PFA em cada coluna é fundamental. Isso garante que o tempo de estimulação e coloração dos neutrófilos de cada poço permaneça consistente. Devido ao curto tempo de vida dos neutrófilos, todo o experimento, desde a coleta de sangue de doadores até a conclusão da citometria de fluxo, deve ser reali…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Evan Jellison e à Sra. Li Zhu no núcleo de citometria de fluxo da UConn Health por sua assistência com a citometria de fluxo, à Dra. Lynn Puddington no Departamento de Imunologia da UConn Health por seu apoio aos instrumentos, à Sra. Slawa Gajewska e ao Dr. Paul Appleton no núcleo de pesquisa clínica da UConn Health por sua ajuda na obtenção de amostras de sangue. Agradecemos ao Dr. Christopher “Kit” Bonin e ao Dr. Geneva Hargis da UConn School of Medicine por sua ajuda com a redação científica e edição deste manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), EUA, um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira da American Heart Association (18CDA34110426) e um fundo de startups da UConn Health. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
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Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
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