Undersøgelse af langdistancetransport af perfluoralkylsyrer i hvede via en split-root eksponeringsteknik

Perfluoralkylsyrer (PFAA'er) anvendes i vid udstrækning i forskellige kommercielle og industrielle produkter på grund af deres fremragende fysisk-kemiske egenskaber, herunder overfladeaktivitet og termisk og kemisk stabilitet ^1,2,3. Perfluoroctansulfonsyre (PFOS) og perfluoroctansyre (PFOA) er de to vigtigste PFAA'er, der anvendes på verdensplan ^4,5,6, selvom disse forbindelser blev opført i den internationale Stockholmkonvention i henholdsvis 2009 og 2019 ^7,8. På grund af deres vedholdenhed og udbredte anvendelse er PFOS og PFOA blevet bredt påvist i forskellige miljømatricer. Koncentrationerne af PFOA og PFOS i overfladevand fra forskellige verdensomspændende floder og søer er henholdsvis 0,15-52,8 ng/L og 0,09-29,7 ng/l⁹. På grund af brugen af grundvand eller genvundet vand til kunstvanding og også brug af biosolider som gødning er PFOA og PFOS bredt til stede i jorden, der spænder mellem 0,01-123 μg / kg og 0,003-162 μg / kg, henholdsvis¹⁰, hvilket kan indføre en stor mængde PFAA'er i planter og udgøre potentielle risici for menneskers sundhed. PFAA-koncentrationerne (C4-C8) i landbrugsjord og korn (hvede og majs) viser en positiv lineær korrelation¹¹. Derfor er det bydende nødvendigt at undersøge akkumulering og translokation af PFAA'er i planter.

Translokationen af PFAA'er i planter sker først og fremmest fra rødderne til det overjordiske væv, og translokationen af PFAA'er fra rødderne til det spiselige væv betragtes som langdistancetransport^12,13. Tidligere undersøgelser har påvist bisphenol A, nonylphenol og naturlige østrogener i grøntsager og frugter¹⁴, hvilket indebærer, at disse kemikalier kan migrere via phloem. Derfor er det vigtigt at afdække translokationen af PFAA'er i planter for at vurdere deres potentielle risiko. Akkumuleringen og translokationen af PFAA'er påvirkes imidlertid af deres biotilgængelighed i jorden, så det er ikke let at evaluere translokationsevnen for målPFAA'er i planter. Derudover er hydroponiske eksperimenter generelt begrænset af flere faktorer, hvilket gør det vanskeligere at erhverve planternes spiselige væv. Typisk blev phloem indsamlet direkte fra planter for at observere translokationen af organiske forbindelser gennem lange afstande i planter, mens det er vanskeligt at erhverve floemer fra planteplanter¹⁵. Derfor blev en enkel og effektiv metode, split-root-teknikken, introduceret for at studere translokationen af PFAA'er i planter under relativt kortvarig eksponering. Hvad angår split-root-undersøgelsen, er rødderne i en planteplante adskilt i to dele; den ene del anbringes i næringsopløsningen indeholdende målPFAA'er (rør A), og den anden anbringes i næringsopløsningen i fravær af PFAA'er (rør B). Efter eksponering i flere dage måles PFAA'erne i rør B ved LC-MS/MS. Koncentrationen af PFAA'er i rør B afslører translokationspotentialet for PFAA'er gennem phloem i planter^16,17,18.

Split-root-eksperimentet er blevet rapporteret til undersøgelse af langdistancetranslokationen af mange forbindelser i planter, såsom CuO nanopartikler¹⁷, steroidøstrogener 18 og organophosphatestere¹⁶. Disse undersøgelser gav bevis for, at disse forbindelser kunne overføres via phloem til de spiselige plantedele. Det skal dog undersøges nærmere, om PFAA'er kan bidrage til translokation i planter og virkningen af sammensatte egenskaber. Baseret på disse rapporter blev split-root-eksperimentet udført i denne undersøgelse for at afsløre langdistancetransport af PFAA'er i hvede.

Hvedefrø, Triticum aestivum L., blev indkøbt (se Materialetabel) og anvendt til denne undersøgelse.

1. Spiring af hvedefrøplanter og hydroponisk kultur

1. Vælg hvedefrø af samme størrelse og desinficer dem i 15 minutter med 8% (w / w) hydrogenperoxidopløsning.
2. Skyl de desinficerede frø grundigt med deioniseret vand, og læg dem derefter på fugtigt filterpapir i mørke ved stuetemperatur for at spire i 5 dage.
3. Der udvælges ca. ni spirede frøplanter af ensartet størrelse, og de overføres til plastbægre med 250 ml næringsopløsning (1/4 styrke af Hoaglands opløsning; dets kemiske sammensætning er vist i tabel 1).
   OBS: Ud af de ni frø blev tre hver udvalgt til henholdsvis blank, PFOA og PFOS.
4. Planterne dyrkes i vækstkamre i 7 dage før eksponering med en cyklus på 14 timer ved 22 °C og 10 timer ved 27 °C.

2. Eksperimentet med rodopdeling

1. Udfør frøplantedyrkningen i to 50 ml centrifugerør (A og B).
   BEMÆRK: I centrifugerør A var 50 ml steril 1/4 styrke Hoaglands opløsning til stede, og den samme mængde næringsopløsning var til stede i centrifugerør B.
   1. Den kommercielle PFOA og PFOS opløses i methanol og fortyndes med den sterile næringsopløsning som stamopløsning. Derefter tilsættes stamopløsningen til rør B ved en PFOA/PFOS-koncentration på 100 μg/l.
   2. Udfør behandlingerne i tre eksemplarer med en tom kontrol for at overvåge baggrundsforureningen. Et skematisk diagram over split-root-eksponeringseksperimenterne er vist i figur 1.
2. Adskil hvedeplantens hele rødder ved hjælp af pincet i to lige store dele, så rødderne stadig er tilsluttet det samme skud, og indsæt dem forsigtigt i henholdsvis rør A og B.
3. Forsegl de to rør med aluminiumsfolie og dyrk dem i en inkubator i 7 dage. Oprethold de samme inkubationsbetingelser som angivet i trin 1.4.
4. Saml hvedeplanterne efter 7 dages kultur og adskil hveden i tre dele: skud og rødder dyrket i henholdsvis den spidsede opløsning af PFAA'er og ikke-spiked opløsning ved hjælp af steriliseret saks.
5. Frysetørrer planteprøverne i en fryser ved -55 °C i 48 timer.
6. Homogeniser og vej roden og skyd prøver. Saml prøverne af spids og ikke-spidset opløsning.

3. Udvinding af PFOA og PFOS fra plantevæv

1. Der tilsættes 2 ml natriumcarbonatbuffer (0,25 mol/l), 1 ml tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,5 mol/l) og 5 ml methyltert-butylether (se materialetabel) til et 15 ml polypropylenrør, inklusive den homogeniserede rod eller skud.
2. Rør rystes ved 250 o / min i 20 minutter og centrifuge ved 2.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur for at opnå den supernatant organiske fase. Udfør ekstraktionsprocessen to gange.
3. Bland de opsamlede ekstrakter, fordamp til tørhed i en blid nitrogenstrøm (_N2), og rekonstituer derefter med 5 ml methanol og hvirvel dem, idet den samme hastighed opretholdes i ca. 30 s.
4. Konditioner pesticarbpatronen (se Materialetabel) med 5 ml 0,1% NH₄OH i methanol, 5 ml vand og 5 ml methanol.
5. Tilsæt 5 ml ekstraktion af methanolopløsning gennem pesticarbpatronen (500 mg / 6 ml) for at fjerne pigmentet, eluere patronen med 5 ml methanol og samle i de samme rør.
6. Den opsamlede 10 ml methanolopløsning inddampes til næsten tørhed og rekonstitueres med 200 μL methanol efterfulgt af hvirveldannelse og centrifugering ved 10.000 x g i 20 minutter ved stuetemperatur.

4. Prøveforberedelse fra næringsopløsningen

1. Betingelse med 5 ml methanol og 5 ml vand for at aktivere den polære forbedrede polymer (PEP) ekstraktionspatron (60 mg / g, 3 ml) (se materialetabel).
2. Der tilsættes henholdsvis 1 ml af spidsopløsningen eller 50 ml af prøverne af den ikke-spidsede opløsning (trin 2.6) gennem cylinderampullen.
3. Udlys mål-PFAA'erne med 10 ml methanol, ekstraktet inddampes med blid_N2, og rekonstitueres derefter med 200 μL methanol til analyse.

5. Instrumentel analyse

1. Brug en ultra-performance væskekromatografi UPLC kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS / MS) til kvantificering af målPFAA'erne i multireaktionstilstand (MRM) og negativ elektrosprayionisering (ESI-) (se Materialetabel).
2. 10 μL prøver injiceres, og målPFAA'erne adskilles ved hjælp af en C18-væskekromatografisk søjle (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, se materialetabel), og der anvendes 2 mM ammoniumacetat i vand (fase A) og methanol (fase B) som mobilfase for UPLC med en strømningshastighed på 0,3 ml/min. Søjletemperaturen holdes ved 50 °C.
   BEMÆRK: Ionovergangene for PFOA og PFOS er henholdsvis 413 til 369 og 499 til 80. Gradientelueringsprogrammet og de LC-MS/MS instrumentelle parametre til kvantificering af mål-PFAA'erne er anført i tabel 2.
3. Behandl dataene med dataanalysesoftwaren (se Materialetabel).

Split-root-eksperimentet undersøgte langdistancetransporten af PFAA'er i hvede. Som vist i figur 2A,C kunne både PFOA og PFOS optages af hvederoden og overføres til skuddet. PFOS og PFOA blev ikke påvist i hvederoden og opløsningen i rør A i blindprøven. Det blev konstateret, at PFOS og PFOA blev påvist i hvederødderne dyrket i den ikke-spidsede opløsning med en koncentration på henholdsvis 0,26 ng/g ± 0,02 ng/g og 0,64 ng/g ± 0,05 ng/g tørvægt (dw) (n = 3), som tegner sig for henholdsvis 1,5 % og 1,8 % af akkumuleringsmængden i fuldkornsplanten. Dette resultat tyder på, at PFOS og PFOA kan opleve langdistancetransport gennem floemet fra skuddet til roden. Det var værd at bemærke, at PFOS og PFOA også blev fundet i den ikke-spidsede næringsopløsning med en koncentration på henholdsvis 17,8 ng/l ± 0,28 ng/l og 28,5 ng/l ± 5,9 ng/L (n = 3), hvilket tyder på, at PFOA og PFOS kunne passere gennem den caspariske rodstrimmel^19,20 og frigives i det omgivende miljø. Resultaterne fra det nuværende arbejde giver solid dokumentation for, at langdistancetransport også er en vigtig vej for hvede til at eliminere PFAA'er.

Figur 1: Skematisk diagram over split-root eksperimenterne. Hele rødderne af hvedeplanten blev ligeligt adskilt i to dele og omhyggeligt indsat i rør (A) og (B). En hydroponisk plastrodholder med en matchende svamp blev brugt til at forbinde de to rør og fastgøre frøplanten. Den tomme gruppe er indstillet til løsningen i A; B-rør er alle uspidsede. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Fordeling af PFOA- og PFOS-koncentrationer i split-root-eksperimentet efter 7 dages eksponering. Den spidsede opløsning (opløsning indeholdende målPFAA'er), spidsrod (rod i PFAAs-spiked opløsning) og skud af (A) PFOA og (C) PFOS. Ikke-spidset opløsning (opløsning uden PFAA'er) og ikke-spidset rod (rod i ikke-spidset opløsning) af (B) PFOA (D) og PFOS. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelserne (n = 3). Forkortelse: dw = tørvægt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Kemiske sammensætninger af 1/4 styrke Hoagland næringsopløsning. Denne næringsopløsning repræsenterer den ikke-spikede opløsning i split-root-eksperimentet.

Tabel 2: LC-MS/MS instrumentelle parametre til kvantificering af mål-PFAA'erne.

For at sikre nøjagtigheden af denne metode skal der foretages omhyggelig behandling for at sikre, at spidsopløsningen i rør B ikke forurener den ikke-spidsede opløsning i rør A. Den givne koncentration af mål-PFAA'er i denne undersøgelse var relativt højere end deres koncentration i det virkelige miljø, hvilket sikrede overvågning af målPFA'er i hvede og ikke-spidset opløsning ved hjælp af LC-MS/MS.

Der er begrænsninger for denne metode. Da der kun blev anvendt én hvedeplante i hver behandlingsgruppe, og roden blev delt i to, kan den oprindelige koncentration af den spidsede opløsning være forholdsvis lav, og jo mindre biomasse opnået ved den endelige behandling kan resultere i, at koncentrationen af PFA'er i rødderne dyrket i den ikke-spidsede opløsning ligger under detektionsgrænsen. På grund af den korte eksponeringstid kunne transporten af PFAA fra rødderne til de spiselige dele af hvede desuden ikke bestemmes. Split-root-eksperimentet kunne kun analysere phloemtransporten af PFAA'er med forskellige egenskaber inden for planter¹⁶.

Denne metode er af stor betydning for forståelsen af langdistancetransporten^12,13 af forurenende stoffer i plantevæv. Ifølge resultaterne kan PFAA'er optages af rødder og transporteres til skud hovedsageligt gennem xylem; Det skal dog bemærkes, at de kan omsættes fra blade til spiseligt væv samt fra skud til rødder gennem floem, hvilket er vigtigt for vurderingen af deres potentielle risiko for translokation i planter. Desuden giver translokationen af PFAA'er fra det overjordiske væv til rødder og derefter frigivelse i det omgivende miljø solid dokumentation for elimineringsvejene for PFAA'er i planter.