Измерение сократительной способности сердца в изолированных первичных кардиомиоцитах взрослого человека

Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Все человеческие сердца, использованные в исследованиях, не подлежали трансплантации и были получены по информированному юридическому согласию (первого лица или ближайших родственников) от трупных доноров органов в Соединенных Штатах (США). Протоколы восстановления и эксперименты in vitro были предварительно одобрены Институциональными наблюдательными советами (IRB) в центрах трансплантации, входящих в Сеть трансплантации органов США (OPTN). Кроме того, все случаи передачи донорских сердец полностью отслеживаются и периодически проверяются федеральными властями США. ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте все необходимые меры безопасности во время выполнения этого протокола, включая ношение соответствующих средств индивидуальной защиты (например, лабораторных халатов, защитных очков, перчаток). 1. Выделение кардиомиоцитов (за 1 сутки до измерения сократительной способности) Реперфузию донорских сердец сразу по прибытии в лабораторию проводят ледяной запатентованный кардиоплегический раствор6 и ферментативно выделяют первичные миоциты взрослого человека из желудочков 11,12,13,14,15. Затем поддерживают кардиомиоциты во взвешенном состоянии и хранят их в 10 мл раствора А (110 мМ сахарозы, 0,005 мМ CaCl 2, 3 мМ MgCl 2, 70 мМ KOH, 60 мМ лактобионовой кислоты, 10 мМ KH 2 PO4, 20 мМ таурина, 20 мМ L-гистидина, 20 мМ HEPES, 2 мМ L-глутаминовой кислоты, 2 мМ L-(-)-яблочной кислоты, pH 7,4 с KOH) во флаконах Wheaton по 20 мл (таблица материалов) при охлажденной температуре до тех пор, пока они не будут экспериментально исследованы.ПРИМЕЧАНИЕ: Храните 200 000 клеток во флаконе. 2. Приготовление ламининового покрытия (за 1 сутки до измерения сократительной способности) Поместите один стеклянный покровный лист (квадрат 25 мм x 25 мм, таблица материалов) в каждую лунку восьмилуночной планшета для культуры (таблица материалов). Затем покройте покровные стекла ламинином в концентрации 5 мкг/мл. Для этого добавьте 800 мкл человеческого рекомбинантного материала Laminin 521 (таблица материалов, хранящегося при −20 °C) к 7,2 мл раствора B (145 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl2, 11,1 мМ глюкозы и 10 мМ HEPES, pH 7,4 с NaOH) и хорошо перемешайте. Капните 200 мкл разбавленного раствора ламинина в центр каждого покровного стекла. Затем накройте тарелку крышкой и поставьте в холодильник с температурой 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте несколько восьмилуночных планшетов для культивирования, чтобы убедиться, что имеется достаточное количество покрытых ламинином покровных стекол. 3. ПодготовкаСа2+-толерантных кардиомиоцитов (в день измерения сократительной способности) Достаньте флакон с клетками из холодильника, отсосите раствор А из флакона и добавьте охлажденные 10 мл раствора Б.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки не отсасываются, и диспергируйте раствор B во флакон, поместив пипетку на внутреннюю часть верхней стенки флакона. Закройте флакон с клетками, а затем осторожно взболтайте, чтобы убедиться, что клетки распределены по раствору B. Наконец, дайте клеткам отстояться в течение 1 часа при комнатной температуре (RT). 4. Подготовка регистрирующей системы (в день измерения сократительной способности) ПРИМЕЧАНИЕ: Система регистрации включает в себя блок контроля температуры, стимулятор, управляемую компьютером перфузию под давлением, перфузионные флаконы под давлением, собственное программное обеспечение для сбора данных, позволяющее выбирать интересующие области (ROI) и отображать переходные процессы сократимости, инвертированный микроскоп, клеточную камеру и камеру (рис. 1). Включите вакуумную систему всасывания. Затем снимите крышку микроскопа, включите ее, подключите камеру (Таблица материалов, рис. 1) и, наконец, убедитесь, что вентилятор включен, чтобы убедиться, что камера не перегревается. Затем включите нагревательную пластину микроскопа (Таблица материалов) и блок контроля температуры (Таблица материалов, Рисунок 1) и установите для них надлежащую рабочую температуру. Далее включаем стимулятор поля (Таблица материалов, рисунок 1) и систему давления. Наконец, подсоедините трубку раствора (Таблица материалов) к записывающей камере (Таблица материалов, Рисунок 1). 5. Приготовление испытуемых компаундов (в день измерения сократительной способности) Разбавленный диметилсульфоксид (ДМСО; Содержание материалов) 1000 раз в растворе C (145 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl2, 11,1 мМ глюкозы и 10 мМ HEPES, pH 7,4 с NaOH) для получения 0,1% раствора ДМСО. Чтобы испытать соединение при 1-кратном, 10-кратном, 100-кратном и 1000-кратном терапевтическом воздействии 0,001 мкМ, растворяют исследуемое соединение в ДМСО в концентрации 1 мМ. Последовательно разбавляйте этот раствор ДМСО для получения еще трех запасов ДМСО (например, 0,001 мМ, 0,01 мМ и 0,1 мМ). Наконец, разбавьте каждый тестовый материал в 1000 раз в 100 мл раствора С для получения окончательных концентраций (0,001 мкМ, 0,01 мкМ, 0,1 мкМ и 1 мкМ). Добавьте раствор носителя и растворы конечных микромолярных концентраций соединения в стеклянные бутылки объемом 100 мл (таблица материалов, рисунок 1), а затем подключите флаконы к системе перфузии под давлением (таблица материалов, рисунок 1). Затем заправьте перфузионную систему компьютерной программой (таблица материалов), используя давление 200-300 мбар, чтобы обеспечить постоянный поток перфузии со скоростью 1,8 мл/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Не проводите эксперимент, если обнаружено, что исследуемое соединение связано с проблемой растворимости. Кроме того, в течение 30 мин перед экспериментальным нанесением на клетки необходимо приготовить составные тестовые растворы из исходных растворов. 6. Покрытие кардиомиоцитов (в день измерения сократительной способности) Достаньте из холодильника при температуре 4 °C восьмилуночную пластину, содержащую покрытые ламинином листы, и осторожно поместите один покровный лист в очень хорошо очищенную записывающую камеру (рисунок 1). Затем верните восьмилуночную тарелку в холодильник с температурой 4 °C до следующего покрытия.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте безворсовую салфетку (Таблица материалов), чтобы протереть покрытый покровный листок, сохраняя его покрытым тонким слоем ламинина. Кроме того, не забудьте утилизировать использованные покровные стекла в контейнере для острых предметов. Затем возьмите увеличенный флакон с клетками (шаг 3.2) и аспирируйте раствор B из флакона, чтобы достичь как можно меньшего объема без потери клеток (~200 мкл). Затем дозируют 200 мкл клеток в камеру регистрирующего микроскопа, установленную на столике инвертированного микроскопа (таблица материалов). Дайте клеткам осесть на покровном стекле в течение 5 минут. Ожидая, пока клетки полностью осядут, откройте поле зрения микроскопа и определите, достаточна ли плотность клеток (~70%) для начала эксперимента.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что всасывание не отсасывает все клетки, если дозируется более 200 мкл. 7. Регистрация сократительной способности кардиомиоцитов После завершения нанесения покрытия уравновешивайте клетки в течение 5 мин, непрерывно перфузируя их раствором С с помощью перфузионной системы под давлением (таблица материалов). Правильно отрегулируйте всасывание, включите блок контроля температуры и нагревательную пластину и установите их на подачу ~35 °C. Затем стимулируют клетки надпороговым напряжением с частотой стимуляции 1 Гц (биполярный импульс длительностью 3 мс) на стимуляторе поля с парой платиновых проводов, размещенных на противоположных сторонах камеры, подключенных к стимулятору поля. Установите амплитуду стимулирующего импульса на 1 В, а затем увеличивайте ее до тех пор, пока кардиомиоциты не начнут генерировать циклы сокращения-релаксации. Используйте значение 1,5x порогового значения на протяжении всего эксперимента.ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте здоровые клетки с палочковидной морфологией и четкими бороздками. Затем отрегулируйте поле зрения и сосредоточьтесь на том, чтобы привлечь в поле зрения как можно больше сокращающихся ячеек (рис. 2A). Затем отобразите оцифрованные изображения клеток в программном обеспечении системы регистрации оптической сократимости. Это программное обеспечение использует камеру высокого разрешения с высокой частотой кадров и частотой кадров 150 кадров в секунду (таблица материалов, рис. 1) для записи видеопотока, содержащего несколько миоцитов в одном кадре.ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает достаточное временное и пространственное разрешение для захвата и измерения динамики саркомеров нескольких здоровых миоцитов одновременно. Современные процессоры с большим количеством ядер позволяют параллельно вычислять изменения длины саркомеров из видеопотока в режиме реального времени (данные об оптической плотности собираются из пользовательских областей интереса [ROI], размещенных поверх изображений здоровых кардиомиоцитов и параллельных оси сокращения, рис. 2B). Данные оптической интенсивности показывают светлые и темные полосы, соответствующие Z-линиям кардиомиоцитов (рис. 1, рис. 2В). Наконец, эти данные отображаются пользователю в целях мониторинга и сохраняются на диске для последующего анализа (рис. 2C).Избегайте областей клеток, которые не находятся в фокусе. Кроме того, не располагайте ROI близко к краю клеток, так как изменения в сокращении клеток во время применения лекарств могут привести к тому, что ROI не смогут прочитать сокращение клеток. Когда выбор ROI завершен и сокращения соответствуют необходимым стандартам для использования (например, укорочение саркомера >1%; ритмичное сокращение при применении частоты стимуляции 1 Гц, отсутствие аритмических событий), приступают к эксперименту по оценке эффектов соединения. Протокол стимуляции и последовательность применения исследуемых концентраций соединения приведены в таблице 1. Программное обеспечение для сбора данных будет управлять сбором и отображением данных, а также маркировкой концентраций теста и времени обработки.ПРИМЕЧАНИЕ: Применяйте тестовые концентрации, если сокращение остается со стабильной амплитудой в течение всего базового периода транспортного средства. Дисквалифицировать ячейки, отображающие разгон вверх или вниз. Кроме того, убедитесь, что перфузия переключается на различные тестовые концентрации на протяжении всего эксперимента. По завершении эксперимента и сохранения данных на сервере выключите перфузию и нагреватель, остановите стимуляцию, очистите камеру микроскопа дистиллированной водой, затем снимите стеклянное покровное стекло и тщательно высушите камеру.ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите камеру, так как это очень важно, чтобы избежать преждевременного воздействия какого-либо соединения на следующий набор клеток, что приведет к аннулированию любых собранных данных. Затем выполняют новое покрытие кардиомиоцитов и проводят дополнительный эксперимент для получения достаточного количества данных для завершения тестирования соединения или тестирования нового соединения. 8. Выключение системы регистрации оптической сократимости После завершения ежедневного тестирования соединения (соединений) сначала выключите все оборудование, которое не требуется для очистки системы, и скопируйте данные для автономного анализа. Затем извлеките стеклянные флаконы объемом 100 мл (Таблица материалов), содержащие растворы конечных тестовых концентраций, и замените их стеклянными бутылками, наполовину заполненными раствором концентрата RBS 25 (Таблица материалов). Прокачайте раствор RBS через камеру микроскопа в течение 5 мин, затем отсоедините перфузионную трубку от камеры, очистите ее дистиллированной водой и, наконец, тщательно высушите.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пылесос работает хорошо, чтобы предотвратить возможное затопление. Затем подсоедините перфузионную трубку к дренажной трубке. Используя программное обеспечение системы перфузии под давлением (таблица материалов), запустите раствор RBS в течение 10 минут, убедившись, что давление и скорость потока установлены надлежащим образом. Затем проводят перфузию 1% ДМСО в течение 5 мин, а затем дистиллированную воду в течение 15-20 мин для завершения очистки перфузионной системы. Выключите свет микроскопа и наденьте его крышку. Затем отсоедините провода камеры от коробки сбоку микроскопа и выключите вентилятор. Убедитесь, что все использованные бутылки отправлены на очистку и в автоклав. Наконец, убедитесь, что все дренажные ведра заполнены на 1/4 или меньше.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что имеется достаточное количество покровных стеблей с ламининовым покрытием для использования на следующий день. Наконец, скопируйте файлы в папку сбора данных обо всех экспериментах, проведенных на каждой системе записи, и вставьте их на защищенный сервер резервного копирования для дополнительного автономного анализа. Затем удалите все файлы данных из папки сбора. 9. Анализ данных о сократительной способности Выполняйте автономный анализ с помощью аналитического программного обеспечения и специально созданного макроса для усреднения данных. Аналитическое программное обеспечение рассчитывает и сообщает различные показатели на основе данных динамики саркомеров, полученных с помощью программного обеспечения для сбора данных. Подробный список этих параметров приведен на рисунке 2D.ПРИМЕЧАНИЕ: Применение низкоуровневых программных методов позволяет анализировать многие прогоны записей за 5 с. Основным параметром для оценки лекарственно-индуцированных изменений сократительной способности является амплитуда сократимости (% укорочения саркомера = изменение длины саркомера). Она рассчитывается как длина саркомера при пиковой длине сокращения/покоя и усредняется за последние 20 переходных процессов сократимости для каждой тестовой концентрации. Количественно оценить влияние исследуемого соединения на усредненную амплитуду сократимости по отношению к конкретному исходному состоянию контроля носителя каждого кардиомиоцита. Выразите средние результаты в виде среднего значения ± СЭМ и постройте график, показывающий влияние концентрации испытуемого соединения на амплитуду сократимости. Затем подгоните кривую «концентрация-реакция» к уравнению Хилла с помощью аналитического программного обеспечения (таблица материалов), чтобы получить значения IC50 (концентрация, приводящая к 50%-ному подавлению амплитуды сократимости) и EC50 (концентрация, приводящая к увеличению амплитуды сократимости на 50%). Помимо амплитуды сократимости, можно рассчитать и другие параметры:Послесокращение: Определите послесокращение как спонтанное вторичное транзиторное сокращение кардиомиоцита, которое происходит перед следующей регулярной схваткой и вызывает аномальное и несинхронизированное сокращение. Сбой схватки: Определите неудачу схватки как неспособность электрического стимула вызвать сокращение. Краткосрочная изменчивость (STV) и альтерны: Визуализируйте эти два параметра на графиках вариабельности амплитуды сокращения Пуанкаре.Расчет STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) с последними 20 переходными процессами каждого периода концентрации контрольного и испытуемого изделия. Определите альтернаны как повторяющиеся чередующиеся короткие и длинные переходные процессы амплитуды сократимости. Чтобы рассчитать частоту возникновения проаритмии, нормализуйте значения STV к контрольному значению носителя каждой клетки, постройте график послесокращения, неудачи сокращения, STV и альтернанов и выразите их в % от частоты появления клеток, демонстрирующих каждый из сигналов. Завершите многопараметрическое механистическое профилирование расчетом времени Ato пика, затухания до 30% релаксации (Decay 30), затухания до 90% релаксации (Decay 90), времени до 90% релаксации (TR90) (Рисунок 2D), базовой длины саркомера, времени до пика 50%, пиковой высоты, длины саркомера при пиковой сократимости, максимальной скорости сжатия и максимальной скорости релаксации12. Как и амплитуду сократимости, выразите эти параметры относительно конкретного исходного контрольного состояния каждого кардиомиоцита и отобразите их на графиках «концентрация-реакция».