単離された成人ヒト一次心筋細胞における心臓収縮性の測定

すべての方法は、関連するガイドラインと規制に従って実施されました。研究に使用されたすべてのヒトの心臓は移植不可能であり、米国(US)の死体臓器提供者からのインフォームド・リーガル・コンセント(本人または近親者)によって倫理的に入手された。回復プロトコルと in vitro 実験は、米国臓器調達移植ネットワーク(OPTN)内の移植センターの治験審査委員会(IRB)によって事前承認されました。さらに、ドナーの心臓のすべての移植は完全に追跡可能であり、米国連邦当局によって定期的に見直されます。 注意: このプロトコルの実行中は、適切な個人用保護具(実験室用コート、安全メガネ、手袋など)の着用を含む、必要なすべての安全手順を適用してください。 1.心筋細胞の単離(収縮性測定の1日前) ドナーの心臓は、実験室に到着したらすぐに氷冷した独自の心臓麻痺溶液6で再灌流し、脳室から酵素的に成人のヒト一次筋細胞を分離します11、12、13、14、15。 次いで、心筋細胞を懸濁液中に維持し、10mLの溶液A(110mMスクロース、0.005mMCaCl2、3mMMgCl2、70mMKOH、60mMラクトビオン酸、10mMKH2PO4、20mMタウリン、20mML-ヒスチジン、20mMHEPES、2mML-グルタミン酸、2mML-(-)-リンゴ酸、 pH 7.4 with KOH)を20 mLウィートンバイアル(材料表)に入れ、実験的に調べるまで冷蔵温度で加熱します。注:バイアルごとに200,000個の細胞を保管してください。 2.ラミニンコーティングの準備(収縮性を測定する1日前) ガラスカバーガラス1枚(25 mm x 25 mm角、材料表)を8ウェル培養プレートの各ウェルに置きます(材料表)。 次に、カバーガラスを5 μg/mLの濃度のラミニンでコーティングします。これを行うには、800 μL のヒト組換えラミニン 521 ストック(材料表、-20°C で保存)を 7.2 mL の溶液 B (145 mM NaCl、4 mM KCl、2.5 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、11.1 mM グルコース、10 mM HEPES、pH 7.4 with NaOH) に加え、よく混合します。 希釈したラミニン溶液200 μLを各カバーガラスの中央に滴下します。次に、プレートに蓋をして、4°Cの冷蔵庫に積み重ねます。注:ラミニンでコーティングされたカバーガラスが十分にあることを確認するために、複数の8ウェル培養プレートを準備します。 3.Ca2+耐性心筋細胞の調製(収縮性測定当日) 冷蔵庫から細胞のバイアルを取り出し、バイアルから溶液Aを吸引し、冷蔵した10 mLの溶液Bを加えます。注:細胞が吸引されていないことを確認し、バイアル壁の上部の内側にピペットを置いて、溶液Bをバイアルに分散させます。 細胞のバイアルに蓋をし、静かに渦を巻いて、細胞が溶液B全体に分散するようにします。最後に、細胞を室温(RT)で1時間沈降させます。 4.記録システムの準備(収縮性測定当日) 注:記録システムには、温度制御ボックス、刺激装置、コンピューター制御の圧力駆動灌流、圧力駆動灌流ボトル、関心領域(ROI)の選択と収縮性過渡現象の表示を可能にする社内取得ソフトウェア、倒立顕微鏡、細胞チャンバー、およびカメラが含まれています(図1)。 吸引真空システムをオンにします。次に、顕微鏡カバーを取り外して電源を入れ、カメラを接続し(材料表、 図1)、最後にファンがオンになっていることを確認して、カメラが過熱しないようにします。 次に、顕微鏡加熱プレート(材料表)と温度制御ボックス(材料表、図1)の電源を入れ、適切な動作温度に設定します。次に、電界刺激装置(材料表、図1)と圧力システムをオンにします。最後に、溶液のチューブ(材料表)を記録チャンバー(材料表、図1)に接続します。 5. 試験化合物の調製(収縮性測定当日) 希薄ジメチルスルホキシド(DMSO;資料表)溶液C(145 mM NaCl、4 mM KCl、1.8 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、11.1 mMグルコース、10 mM HEPES、pH 7.4、NaOH)中で1,000倍して、0.1% DMSOビヒクル溶液を作製します。 治療曝露量0.001 μMの1倍、10倍、100倍、1000倍で化合物を試験するには、試験化合物を1 mMの濃度でDMSOに溶解します。 この溶液をDMSOで段階的に希釈し、さらに3つのDMSOストック(例:0.001 mM、0.01 mM、0.1 mM)を生成します。最後に、各試験化合物ストックを100 mLの溶液Cで1,000倍に希釈して、最終試験濃度(0.001 μM、0.01 μM、0.1 μM、および1 μM)を取得します。 ビヒクル溶液と化合物の最終マイクロモル濃度の溶液を 100 mL のガラスボトルに添加し(材料表、図 1)、ボトルを圧力駆動灌流システムに接続します(材料表、図 1)。 次に、200〜300 mbarの圧力を使用してコンピューター駆動プログラム(材料表)で灌流システムをプライミングし、1.8 mL / minの速度で一定の灌流流量を供給します。注:試験化合物が溶解性の問題に関連していることが判明した場合は、実験を行わないでください。また、細胞への実験的適用の30分以内に原液から化合物試験溶液を調製します。 6.心筋細胞のプレーティング(収縮性測定当日) ラミニンコーティングされたカバーガラスが入った8ウェルプレートを4°Cの冷蔵庫から取り出し、1枚のカバーガラスを非常によく洗浄された記録チャンバーに慎重に置きます(図1)。次に、8ウェルプレートを4°Cの冷蔵庫に戻して、次のメッキを行います。注意: 糸くずの出ないワイプ(材料表)を使用して、カバーガラスをラミニンの薄層でコーティングしたまま、コーティングされたカバーガラスを拭き取ります。また、使用済みのカバーガラスは必ず鋭利な容器に廃棄してください。 次に、エスカレートした細胞のバイアルを取り出し(ステップ3.2)、バイアルから溶液Bを吸引して、細胞を失わずにできるだけ小さな容量(~200 μL)に到達します。次に、200μLの細胞を倒立顕微鏡のステージに取り付けた記録顕微鏡チャンバーに分注します(材料表)。 細胞をカバーガラスに5分間沈殿させます。細胞が完全に沈殿するのを待っている間に、顕微鏡で視野を開き、細胞密度が実験を開始するのに十分(~70%)であるかどうかを判断します。注:200 μLを超える分注を行う場合は、吸引によってすべての細胞が吸引されないようにしてください。 7.心筋細胞の収縮性の記録 めっき終了後、圧力駆動灌流システム(材料表)を用いて溶液Cと連続的に灌流することにより、セルを5分間平衡化します。吸引を正しく調整し、温度制御ボックスと加熱プレートの両方をオンにして、~35°Cになるように設定します。 次に、1Hzのペーシング周波数(3msのバイポーラパルス)で、電界刺激装置に接続されたチャンバーの反対側に配置された一対の白金線を使用して、電界刺激装置で超閾値電圧で細胞を刺激します。 刺激パルスの振幅を1Vに設定し、心筋細胞が収縮-緩和サイクルを生成し始めるまで振幅を上げます。実験全体で 1.5 倍のしきい値を使用します。注:棒状の形態と明確な縞模様を持つ健康な細胞を選択してください。次に、視野を調整し、できるだけ多くの収縮セルを視野に入れることに焦点を合わせます(図2A)。 次に、細胞のデジタル化された画像を光収縮記録システムの取得ソフトウェアに表示します。このソフトウェアは、150 FPSの高解像度、高フレームレートのカメラ(材料表、 図1)を使用して、同じフレームに複数の筋細胞を含むビデオストリームを記録します。注:これにより、複数の健康な筋細胞のサルコメア動態を同時に捕捉および測定するのに十分な時間的および空間的分解能が得られます。最新の高コア数プロセッサは、ビデオストリームからのサルコメア長の変化をリアルタイムで並列計算するために活用されています(光学濃度データは、健康な心筋細胞の画像上に配置され、収縮軸に平行に配置されたユーザー定義の関心領域(ROI)から収集されます( 図2B)。光強度データは、心筋細胞のZ線に対応する明るいバンドと暗いバンドを示しています(図1、 図2C)。最後に、これらのデータは監視目的でユーザーに表示され、後で分析するためにディスクに保存されます(図2C)。焦点が合っていないセルの領域は避けてください。また、薬剤の適用中に細胞の収縮が変化すると、ROIが細胞の収縮を読み取れなくなる可能性があるため、ROIを細胞の端の近くに配置しないでください。 ROIの選択が完了し、収縮が使用に必要な基準を満たしている場合(例:サルコメア短縮>1%、1Hzのペーシング周波数を適用した場合のリズミカル収縮、不整脈イベントの欠如)、実験を開始して化合物の効果を評価します。刺激プロトコルと化合物の試験濃度の適用順序を 表1に示します。取得ソフトウェアは、データの取得と表示、および検査濃度と処理時間のラベル付けを自動的に管理します。注意: 収縮がベースライン車両期間全体を通じて安定した振幅にとどまる場合は、テスト濃度を適用します。ランナップまたはランダウンのいずれかを表示しているセルを失格にします。 また、実験全体を通して、灌流が異なる試験濃度に切り替わっていることを確認してください。 実験とサーバーへのデータ保存が完了したら、灌流とヒーターのスイッチを切り、刺激を停止し、顕微鏡チャンバーを蒸留水で洗浄し、ガラスカバーガラスを取り外し、チャンバーを完全に乾燥させます。注:チャンバーを完全に洗浄することは、次の細胞セットを早期に化合物に曝露して収集したデータを無効にすることを避けるために重要です。 次に、心筋細胞の新しいめっきを行い、化合物の試験を完了するか、新しい化合物を試験するのに十分なデータを得るために追加の実験を行います。 8.光収縮性記録システムをオフにする 化合物の毎日の試験が完了したら、まずシステムの洗浄に必要のないすべての機器の電源を切り、オフライン分析のためにデータをコピーします。 次に、最終試験濃度の溶液が入った100 mLのガラス瓶(材料表)を取り出し、RBS 25濃縮液(材料表)で半分満たされたガラス瓶と交換します。RBS溶液を顕微鏡チャンバーに5分間通した後、チャンバーから灌流チューブを外し、蒸留水で洗浄し、最後に完全に乾燥させます。注意: フラッディングを防ぐために、バキュームがうまく機能していることを確認してください。 次に、灌流チューブをドレナージチューブに接続します。圧力駆動灌流システムのソフトウェア(材料表)を使用して、圧力と流量が適切に設定されていることを確認しながら、RBS溶液を10分間実行します。次に、1%DMSOを5分間灌流し、次に蒸留水を15〜20分間灌流して、灌流システムの洗浄を完了します。 顕微鏡のライトを消し、カバーをかぶせます。次に、顕微鏡の側面にあるボックスからカメラワイヤーを抜き、ファンの電源を切ります。使用済みのすべてのボトルが洗浄とオートクレーブのために送られていることを確認してください。最後に、すべての排水バケットが1/4以下であることを確認します。注意: 翌日に使用するのに十分なラミニンコーティングされたカバーガラスがあることを確認してください。 最後に、各記録システムで行われたすべての実験の取得フォルダ内のファイルをコピーし、安全なバックアップサーバーに貼り付けて、オフラインでさらに分析します。次に、取得フォルダからすべてのデータファイルを削除します。 9. 収縮性データの解析 解析ソフトウェアとカスタムメイドのマクロを使用してオフライン解析を実行し、データを平均化します。解析ソフトウェアは、取得ソフトウェアによって生成されたサルコメアダイナミクスデータからさまざまなメトリックを計算して報告します。これらのパラメータの詳細なリストを 図2Dに示します。注:低レベルのソフトウェア技術を適用すると、多くの記録の実行を5秒で分析できます。薬物誘発性の収縮性の変化を評価するための主要なパラメータは、収縮性の振幅です(サルコメア短縮%=サルコメア長の変化)。これは、ピーク収縮/静止時のサルコメア長として計算され、各テスト濃度の最後の 20 回の収縮性過渡現象で平均化されます。 各心筋細胞の特定のベースラインビヒクル制御条件に対する平均収縮性振幅に対する試験化合物の影響を定量化します。 平均結果をSEM±平均として表し、収縮性振幅に対する試験化合物の濃度効果をプロットしたグラフを作成します。次に、解析ソフトウェア(材料表)を用いて濃度-応答曲線をHill式に当てはめ、IC50(収縮振幅を50%抑制する濃度)とEC50(収縮振幅を50%増加させる濃度)の値を導き出します。 収縮性の振幅に加えて、他のパラメータも計算できます。後収縮:後収縮を、次の通常の収縮の前に発生し、異常で同期されていない収縮を引き起こす心筋細胞の自発的な二次収縮の一過性として識別します。 収縮障害:収縮障害を、電気刺激が収縮を誘発できないことと特定します。 短期変動 (STV) と代替: 収縮振幅変動のポアンカレ線図でこれら 2 つのパラメーターを可視化します。STV (∑|CAn + 1 − CAn|(20× √2)−1)各コントロールおよびテスト物の濃縮期間の最後の20回のトランジェント。オルタナンを、短い収縮と長い収縮性の振幅トランジェントを交互に繰り返すものとして識別します。 不整脈誘発性の発生率を計算するには、STV値を各細胞のビヒクル制御値に正規化し、収縮後、収縮不全、STV、およびオルタナンをプロットし、各シグナルを示す細胞の発生率の%として表します。 時間 Ato ピーク、30% 緩和までの減衰 (Decay 30)、90% 緩和までの減衰 (Decay 90)、90% 緩和までの時間 (TR90) (図 2D)、ベースライン サルコメア長、50% ピークまでの時間、ピーク高さ、ピーク収縮性におけるサルコメア長、最大収縮速度、および最大緩和速度12 の計算を使用して、マルチパラメトリック機構プロファイリングを完了します。.収縮性の振幅と同様に、これらのパラメータを各心筋細胞の特定のベースラインコントロール条件に関連させて表し、濃度応答プロットにグラフ化します。