Misurazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti primari umani adulti isolati

Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Tutti i cuori umani utilizzati per gli studi non erano trapiantabili ed eticamente ottenuti con il consenso legale informato (in prima persona o parente prossimo) da donatori di organi da cadavere negli Stati Uniti (USA). I protocolli di recupero e la sperimentazione in vitro sono stati pre-approvati dagli Institutional Review Board (IRB) presso i centri di trapianto all’interno dell’US Organ Procurement Transplant Network (OPTN). Inoltre, tutti i trasferimenti dei cuori dei donatori sono completamente tracciabili e periodicamente rivisti dalle autorità federali statunitensi. NOTA: Applicare tutte le procedure di sicurezza necessarie durante l’esecuzione di questo protocollo, compreso l’uso di dispositivi di protezione individuale appropriati (ad es. camici da laboratorio, occhiali di sicurezza, guanti). 1. Isolamento dei cardiomiociti (1 giorno prima della misurazione della contrattilità) Riperfondere i cuori dei donatori immediatamente dopo l’arrivo in laboratorio con la soluzione cardioplegica brevettata ghiacciata6 e isolare enzimaticamente i miociti primari umani adulti dai ventricoli 11,12,13,14,15. Quindi, mantenere i cardiomiociti in sospensione e conservarli con 10 mL di soluzione A (110 mM saccarosio, 0,005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM acido lattobionico, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurina, 20 mM L-istidina, 20 mM HEPES, 2 mM acido L-glutammico, 2 mM acido L-(-)-malico, pH 7,4 con KOH) in flaconcini di Wheaton da 20 mL (Table of Materials) a temperatura refrigerata fino a quando non vengono interrogati sperimentalmente.NOTA: Conservare 200.000 cellule per flaconcino. 2. Preparazione del rivestimento in laminina (1 giorno prima della misurazione della contrattilità) Posizionare un singolo vetrino coprioggetti (quadrato 25 mm x 25 mm, Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a otto pozzetti (Tabella dei materiali). Quindi, rivestire i vetrini coprioggetti con laminina a una concentrazione di 5 μg/mL. A tal fine, aggiungere 800 μL di Laminina 521 ricombinante umana (Tabella dei materiali, conservata a −20 °C) a 7,2 mL di soluzione B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM di glucosio e 10 mM di HEPES, pH 7,4 con NaOH) e mescolare bene. Far cadere 200 μL della soluzione di laminina diluita al centro di ciascun vetrino coprioggetto. Quindi, coprite il piatto e impilatelo in frigorifero a 4 °C.NOTA: Preparare più piastre di coltura a otto pozzetti per assicurarsi che ci siano abbastanza vetrini coprioggetti rivestiti di laminina. 3. Preparazione di cardiomiociti tolleranti al Ca2+ (il giorno della misurazione della contrattilità) Rimuovere un flaconcino di cellule dal frigorifero, aspirare la soluzione A dal flaconcino e aggiungere 10 ml di soluzione B refrigerata.NOTA: Assicurarsi che le cellule non siano aspirate e disperdere la soluzione B nel flaconcino posizionando la pipetta all’interno della parte superiore della parete del flaconcino. Tappare il flaconcino di cellule e poi agitare delicatamente per assicurarsi che le cellule siano disperse nella soluzione B. Infine, lasciare che le celle si stabilizzino per 1 ora a temperatura ambiente (RT). 4. Preparazione del sistema di registrazione (il giorno della misurazione della contrattilità) NOTA: Il sistema di registrazione include una scatola di controllo della temperatura, uno stimolatore, una perfusione a pressione controllata da computer, flaconi di perfusione a pressione, un software di acquisizione interno che consente la selezione delle regioni di interesse (ROI) e la visualizzazione dei transienti di contrattilità, un microscopio invertito, una camera cellulare e una telecamera (Figura 1). Accendere il sistema di aspirazione dell’aspirazione. Quindi, rimuovere il coperchio del microscopio, accenderlo, collegare la fotocamera (Tabella dei materiali, Figura 1) e, infine, verificare che la ventola sia accesa per assicurarsi che la fotocamera non si surriscaldi. Quindi, accendere la piastra riscaldante del microscopio (Tabella dei materiali) e la scatola di controllo della temperatura (Tabella dei materiali, Figura 1) e impostarle alla temperatura di esercizio corretta. Quindi, accendere lo stimolatore di campo (Tabella dei materiali, Figura 1) e il sistema di pressione. Infine, collegare il tubo della soluzione (Tabella dei materiali) alla camera di registrazione (Tabella dei materiali, Figura 1). 5. Preparazione dei composti in esame (il giorno della misurazione della contrattilità) Dimetil solfossido diluito (DMSO; Tabella dei materiali) 1.000 volte in soluzione C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM di glucosio e 10 mM di HEPES, pH 7,4 con NaOH) per ottenere una soluzione per veicoli DMSO allo 0,1%. Per testare un composto a 1, 10 volte, 100 volte e 1000 volte della sua esposizione terapeutica di 0,001 μM, sciogliere il composto in esame in DMSO a una concentrazione di 1 mM. Diluire questa soluzione in serie con DMSO per produrre altri tre stock di DMSO (ad esempio, 0,001 mM, 0,01 mM e 0,1 mM). Infine, diluire ciascuna riserva di composti in esame 1.000 volte in 100 mL di soluzione C per ottenere le concentrazioni di prova finali (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM e 1 μM). Aggiungere la soluzione del veicolo e le soluzioni delle concentrazioni micromolari finali del composto in flaconi di vetro da 100 mL (Tabella dei materiali, Figura 1) e quindi collegare i flaconi al sistema di perfusione a pressione (Tabella dei materiali, Figura 1). Quindi, adescare il sistema di perfusione con un programma computerizzato (Table of Materials) utilizzando una pressione di 200-300 mbar per fornire un flusso di perfusione costante a una velocità di 1,8 mL/min.NOTA: Non condurre l’esperimento se il composto in esame risulta essere associato a un problema di solubilità. Inoltre, formulare le soluzioni di prova composte dalle soluzioni madre entro 30 minuti prima dell’applicazione sperimentale alle cellule. 6. Placcatura dei cardiomiociti (il giorno della misurazione della contrattilità) Estrarre dal frigorifero a 4 °C una piastra a otto pozzetti contenente vetrini coprioggetti rivestiti di laminina e collocare con cura un vetrino coprioggetti in una camera di registrazione molto ben pulita (Figura 1). Quindi, rimettere la piastra a otto pozzetti nel frigorifero a 4 °C fino alla successiva impiattamento.NOTA: Utilizzare un panno privo di lanugine (Tabella dei materiali) per pulire il vetrino coprioggetto rivestito mantenendo il vetrino coprioggetto ricoperto da un sottile strato di laminina. Inoltre, assicurati di smaltire i vetrini coprioggetti usati in un contenitore per oggetti taglienti. Quindi, prelevare un flaconcino di cellule intensificato (passaggio 3.2) e aspirare la soluzione B dal flaconcino per raggiungere un volume il più piccolo possibile senza perdere cellule (~200 μL). Successivamente, erogare i 200 μL di cellule nella camera del microscopio di registrazione montata sul tavolino di un microscopio invertito (Tabella dei materiali). Lasciare che le cellule si depositino sul vetrino coprioggetto per 5 minuti. Mentre si attende che le cellule si stabilizzino completamente, aprire il campo visivo al microscopio e determinare se la densità cellulare è adeguata (~70%) per l’inizio dell’esperimento.NOTA: Assicurarsi che l’aspirazione non aspiri tutte le cellule se vengono erogati più di 200 μL. 7. Registrazione della contrattilità dei cardiomiociti Al termine della placcatura, equilibrare le celle per 5 minuti perfondendole continuamente con la soluzione C utilizzando il sistema di perfusione a pressione (Tabella dei materiali). Regolare correttamente l’aspirazione, accendere sia la scatola di controllo della temperatura che la piastra riscaldante e impostarle per erogare ~35 °C. Quindi, stimolare le cellule con una tensione superiore alla soglia a una frequenza di stimolazione di 1 Hz (impulso bipolare della durata di 3 ms) su uno stimolatore di campo con una coppia di fili di platino posti ai lati opposti della camera collegata a uno stimolatore di campo. Impostare l’ampiezza dell’impulso stimolante a 1 V, quindi aumentarla fino a quando i cardiomiociti iniziano a generare cicli di contrazione-rilassamento. Usare un valore di soglia pari a 1,5x durante l’esperimento.NOTA: Selezionare cellule sane con morfologia a forma di bastoncino e striature chiare. Quindi, regolare il campo visivo e concentrarsi sul portare in vista il maggior numero possibile di celle contraenti (Figura 2A). Successivamente, visualizzare le immagini digitalizzate delle cellule all’interno del software di acquisizione del sistema di registrazione della contrattilità ottica. Questo software utilizza una telecamera ad alta risoluzione e frame rate con una velocità di 150 FPS (Table of Materials, Figura 1) per registrare un flusso video contenente più miociti nello stesso fotogramma.NOTA: Ciò fornisce una risoluzione temporale e spaziale sufficiente per catturare e misurare contemporaneamente la dinamica del sarcomero di diversi miociti sani. I moderni processori ad alto numero di core vengono sfruttati per consentire il calcolo parallelo delle variazioni della lunghezza del sarcomero dal flusso video in tempo reale (i dati sulla densità ottica sono raccolti da regioni di interesse [ROI] definite dall’utente posizionate sopra le immagini di cardiomiociti sani e parallele all’asse di contrazione, Figura 2B). I dati di intensità ottica mostrano bande luminose e scure corrispondenti alle linee Z dei cardiomiociti (Figura 1, Figura 2C). Infine, questi dati vengono visualizzati all’utente a scopo di monitoraggio e salvati su un disco per un’analisi successiva (Figura 2C).Evita le aree delle celle che non sono a fuoco. Inoltre, non posizionare le ROI vicino al bordo delle cellule, poiché i cambiamenti nella contrazione delle cellule durante l’applicazione dei farmaci possono far sì che le ROI non siano in grado di leggere la contrazione delle cellule. Quando la selezione delle ROI è completata e le contrazioni soddisfano gli standard necessari per l’uso (ad esempio, accorciamento del sarcomero >1%; contrazione ritmica all’applicazione di una frequenza di stimolazione di 1 Hz, assenza di eventi aritmici), iniziare l’esperimento per valutare gli effetti di un composto. Il protocollo di stimolazione e la sequenza di applicazione delle concentrazioni di prova da parte del composto sono riportati nella Tabella 1. Il software di acquisizione gestirà, in modo automatizzato, l’acquisizione e la visualizzazione dei dati e l’etichettatura delle concentrazioni di prova e del tempo di trattamento.NOTA: Applicare le concentrazioni di prova se la contrazione rimane a un’ampiezza stabile per l’intero periodo di riferimento del veicolo. Squalifica le celle che visualizzano una rincorsa o una discesa. Inoltre, assicurarsi che la perfusione sia commutata alle diverse concentrazioni di prova durante l’esperimento. Al termine dell’esperimento e dell’archiviazione dei dati sul server, spegnere la perfusione e il riscaldatore, interrompere la stimolazione, pulire la camera del microscopio con acqua distillata, quindi rimuovere il vetrino coprioggetti e asciugare accuratamente la camera.NOTA: Pulire accuratamente la camera in quanto ciò è fondamentale per evitare di esporre prematuramente il prossimo set di cellule a qualsiasi composto, invalidando così tutti i dati raccolti. Successivamente, eseguire una nuova placcatura dei cardiomiociti ed eseguire un ulteriore esperimento per ottenere dati sufficienti per completare il test del composto o testare un nuovo composto. 8. Disattivazione del sistema di registrazione della contrattilità ottica Al termine dei test giornalieri dei composti, spegnere prima tutte le apparecchiature che non sono necessarie per pulire il sistema e copiare i dati per l’analisi offline. Successivamente, rimuovere i flaconi di vetro da 100 ml (Tabella dei materiali) contenenti le soluzioni delle concentrazioni finali del test e sostituirli con flaconi di vetro riempiti a metà con la soluzione concentrata RBS 25 (Tabella dei materiali). Perfondere la soluzione RBS attraverso la camera del microscopio per 5 minuti, quindi scollegare il tubo di perfusione dalla camera, pulirlo con acqua distillata e, infine, asciugarlo accuratamente.NOTA: Assicurarsi che l’aspirapolvere funzioni bene per evitare possibili allagamenti. Quindi, collegare il tubo di perfusione al tubo di drenaggio. Utilizzando il software del sistema di perfusione a pressione (Tabella dei materiali), far funzionare la soluzione RBS per 10 minuti assicurandosi che la pressione e la portata siano impostate in modo adeguato. Quindi, perfondere DMSO all’1% per 5 minuti e poi acqua distillata per 15-20 minuti per completare la pulizia del sistema di perfusione. Spegnere la luce del microscopio e mettere il coperchio. Quindi, scollegare i cavi della fotocamera dalla scatola sul lato del microscopio e spegnere la ventola. Assicurarsi che tutte le bottiglie usate vengano inviate per la pulizia e l’autoclave. Infine, assicurati che tutti i secchi di drenaggio siano pieni per 1/4 o meno.NOTA: Assicurarsi che ci siano abbastanza vetrini coprioggetti rivestiti di laminina per l’uso il giorno successivo. Infine, copiare i file nella cartella di acquisizione di tutti gli esperimenti eseguiti su ciascun sistema di registrazione e incollarli in un server di backup sicuro per un’ulteriore analisi offline. Successivamente, eliminare tutti i file di dati dalla cartella di acquisizione. 9. Analisi dei dati di contrattilità Esegui l’analisi offline utilizzando il software di analisi e una macro personalizzata per calcolare la media dei dati. Il software di analisi calcola e riporta varie metriche a partire dai dati di dinamica del sarcomero prodotti dal software di acquisizione. Un elenco dettagliato di questi parametri è fornito nella Figura 2D.NOTA: L’applicazione di tecniche software di basso livello consente di analizzare molte sequenze di registrazioni in 5 secondi. Il parametro principale per valutare i cambiamenti della contrattilità indotti dai farmaci è l’ampiezza della contrattilità (% di accorciamento del sarcomero = variazione della lunghezza del sarcomero). Viene calcolata come la lunghezza del sarcomero al picco di contrazione/lunghezza del sarcomero a riposo e calcolata la media degli ultimi 20 transienti di contrattilità per ciascuna concentrazione di prova. Quantificare gli effetti dei composti in esame sull’ampiezza media della contrattilità rispetto alla specifica condizione basale di controllo del veicolo di ciascun cardiomiocita. Esprimere i risultati medi come media ± SEM e produrre un grafico che traccia l’effetto della concentrazione del composto in esame sull’ampiezza della contrattilità. Successivamente, adattare la curva concentrazione-risposta all’equazione di Hill utilizzando un software di analisi (Table of Materials) per derivare i valori IC50 (concentrazione che produce un’inibizione del 50% dell’ampiezza della contrattilità) e EC50 (concentrazione che produce un aumento del 50% dell’ampiezza della contrattilità). Oltre all’ampiezza della contrattilità, è possibile calcolare anche altri parametri:Postcontrazione: Identificare la postcontrazione come una contrazione secondaria spontanea transitoria del cardiomiocita che si verifica prima della successiva contrazione regolare e produce una contrazione anomala e non sincronizzata. Fallimento della contrazione: Identificare il fallimento della contrazione come l’incapacità dello stimolo elettrico di indurre una contrazione. Variabilità a breve termine (STV) e alternanze: visualizza questi due parametri nei diagrammi di Poincaré della variabilità dell’ampiezza di contrazione.Calcolare l’STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) con gli ultimi 20 transitori di ciascun periodo di concentrazione dell’articolo di controllo e dell’articolo di prova. Identificare gli alternani come transitori ripetitivi di contrattilità alternata breve e lunga ampiezza. Per calcolare l’incidenza della pro-aritmia, normalizzare i valori di STV al valore di controllo del veicolo di ciascuna cellula, tracciare la post-contrazione, il fallimento della contrazione, l’STV e le alternanze ed esprimerli come % dell’incidenza delle cellule che presentano ciascuno dei segnali. Completare la profilazione meccanicistica multiparametrica con il calcolo del tempo di picco Ato, del decadimento al 30% di rilassamento (Decadimento 30), del decadimento al 90% di rilassamento (Decadimento 90), del tempo al 90% di rilassamento (TR90) (Figura 2D), della lunghezza del sarcomero basale, del tempo al 50% del picco, dell’altezza del picco, della lunghezza del sarcomero alla contrattilità del picco, della velocità massima di contrazione e della velocità massima di rilassamento12. Come l’ampiezza della contrattilità, esprimere questi parametri relativi alla specifica condizione di controllo basale di ciascun cardiomiocita e rappresentarli graficamente in grafici concentrazione-risposta.