Eritropoez iki ana faza ayrılabilir: erken eritropoez ve eritroid terminal farklılaşması (Şekil 1)^1,2,3. Erken eritropoezde, hematopoetik kök hücreler eritroid soyuna bağlanır ve ilk olarak 1970’lerde yarı katı ortamda koloni oluşturma potansiyellerine dayanarak tanımlanan erken eritroid progenitörlere yol açar 4,5,6,7,8,9 . Genel olarak, eritroid progenitörler iki kategoriye ayrılır: her biri “patlama oluşturan birim eritroid” veya BFU-e ^4,5,6 olarak adlandırılan bir “patlamaya” (daha küçük eritroid hücre kümelerinin büyük bir toplamı) yol açan önceki progenitörler; ve her biri “koloni oluşturan birim eritroid” veya CFU-e ^7,8,9 olarak adlandırılan tek^, küçük bir eritroid hücre kümesi veya kolonisi oluşturan soyları. BFU-e ve CFU-e henüz terminal eritroid genleri eksprese etmemektedir ve morfolojik olarak tanınabilir değildir. Bir dizi kendini yenileme veya genişleme hücresi bölünmesinden sonra, CFU-e, globinler gibi eritroid genlerin indüklendiği ve böylece eritroid terminal farklılaşmasına (ETD^{) geçiş} yaptığı bir transkripsiyonel anahtara uğrar^. ETD sırasında, eritroblastlar, kırmızı hücrelere olgunlaşan retikülositler oluşturmak için enükleasyona uğramadan önce üç ila beş olgun hücre bölünmesine uğrar.

Terminal farklılaşma sırasındaki eritroblastlar başlangıçta proeritroblastlar, bazofilik, polikromatik ve ortokromatik morfolojilerine göre sınıflandırılmıştır. Akış sitometrisinin ortaya çıkışı, hücre büyüklüğüne (ileri saçılma, FSC ile ölçülür) ve iki hücre yüzey belirtecine, CD71 ve Ter119 ^11,12,13’e (Şekil 1) dayalı olarak prospektif sıralama ve izolasyonlarına izin verdi. Bu ve benzeri akım sitometrik yaklaşımları 14, ETD’nin moleküler ve hücresel yönlerinin araştırılmasında devrim yaratarak, in vivo ve in vitro 10,15,16,17,18,19,20 eritroblastların gelişim aşamasına özgü analizine izin vermiştir. CD71/Ter119 yaklaşımı artık eritroid öncüllerin analizinde rutin olarak kullanılmaktadır.

Yakın zamana kadar, CFU-e ve BFU-e’nin fare dokusundan doğrudan, yüksek saflıkta prospektif izolasyonu için benzer, erişilebilir bir akış sitometrik yaklaşımı, araştırmacılardan kaçınmıştır. Bunun yerine, araştırmacılar bu progenitörlerin sadece bir kısmını izole eden akış sitometrik stratejilerini, genellikle aynı akış sitometrik alt kümeleri²¹ içinde birlikte saflaştıran eritroid olmayan hücrelerin varlığında kullanmışlardır. Sonuç olarak, BFU-e ve CFU-e’nin araştırılması, BFU-e ve CFU-e’yi daha önceki kemik iliği progenitörlerinden türeten ve çoğaltan in vitro farklılaşma sistemleriyle sınırlıydı. Daha sonra bu eritroid progenitörle zenginleştirilmiş kültürlerde CFU-e’yi BFU-e’den ayıran akış sitometrik stratejileri uygulamak mümkündür^22,23. Alternatif bir yaklaşım, gebeliğin ortasında fare fetal karaciğerinin Ter119-negatif fraksiyonunda oldukça zenginleştirilmiş olan fetal CFU-e ve BFU-e’yi kullanır 10,24,25. Bununla birlikte, bu yaklaşımların hiçbiri, yetişkin BFU-e ve CFU-e’nin fizyolojik durumlarında in vivo olarak araştırılmasına izin vermez. Mücadelenin büyüklüğü, koloni oluşum analizlerine dayanarak, bu hücrelerin yetişkin kemik iliğinde sırasıyla% 0.025 ve% 0.3 frekansında bulunduğunu hatırlatırken takdir^edilebilir.

Burada açıklanan protokol, yeni hasat edilmiş Kit ⁺ fare kemik iliği hücrelerinin tek hücreli transkriptomik analizine dayanan yeni bir akış sitometrik yaklaşımıdır (Kit, kemik iliğinin tüm erken progenitör popülasyonları tarafından ifade edilir)¹. Yaklaşımımız, Pronk ve ^ark.21,26 tarafından halihazırda kullanılmakta olan bazı hücre yüzey belirteçlerini içermektedir. Eritroid ve diğer erken hematopoetik progenitörleri tanımlayan hücre yüzey belirteçlerinin kombinasyonlarını belirlemek için tek hücreli transkriptomlar kullanıldı (Şekil 2). Spesifik olarak, soy-negatif (Lin^–) Kit ⁺ hücrelerinin CD55 ⁺ fraksiyonu, üçü eritroid yörüngenin bitişik segmentlerini veren beş popülasyona bölünebilir (Şekil 2). Bu popülasyonların her birinin transkriptomik kimlikleri sıralama ile doğrulandı, ardından scRNAseq ve sıralanmış tek hücreli transkriptomların orijinal transkriptomik haritaya geri yansıtılması (beş popülasyonun her birindeki gen ekspresyonu ve tüm kemik iliği veri kümesi https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html’de araştırılabilir)¹ . Popülasyonların her birinin hücre kaderi potansiyeli, geleneksel koloni oluşum testleri (Şekil 2) ve ayrıca yeni bir yüksek verimli tek hücreli kader testi ^1,27 kullanılarak doğrulanmıştır. Bu analizler, yeni akım sitometrik yaklaşımının, taze yetişkin kemik iliği ve dalağının tüm BFU-e ve CFU-e progenitörlerinin yüksek saflıkta izolasyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Spesifik olarak, popülasyon 1 (P1) sadece CFU-e içerir ve başka hematopoetik progenitörler içermez ve popülasyon 2 (P2) kemik iliğinin tüm BFU-e progenitörlerini ve az sayıda CFU-e’yi içerir, ancak başka progenitörleri^{içermez 1}. Aşağıdaki ayrıntılı protokol, salin veya eritropoez uyarıcı hormon eritropoietin (Epo) ile enjekte edilen farelerde yapılan örnek bir deneyle daha da gösterilmiştir.