Эритропоэз можно разделить на две основные фазы: ранний эритропоэз и терминальная дифференциация эритроида (рисунок 1)^1,2,3. В раннем эритропоэзе гемопоэтические стволовые клетки связываются с эритроидной линией и дают начало ранним эритроидным предшественникам, которые были впервые идентифицированы в 1970-х годах на основе их колониеобразующего потенциала в полутвердой среде 4,5,6,7,8,9 . В целом, эритроидные предшественники делятся на две категории: более ранние прародители, каждый из которых порождает «всплеск» (большая совокупность меньших кластеров эритроидных клеток), называемый «взрывообразующим блоком эритроида» или BFU-e ^4,5,6; и их потомство, каждое из которых образует единый небольшой эритроидный клеточный кластер или колонию, названную «колониеобразующей единицей эритроида» или КОЕ-е ^7,8,9. BFU-e и CFU-e еще не экспрессируют терминальные эритроидные гены и не являются морфологически узнаваемыми. После ряда делений самообновления или расширения клеток КОЕ-е подвергается транскрипционному переключателю, при котором индуцируются эритроидные гены, такие как глобины, тем самым переходя в эритроидную терминальную дифференцировку (ETD)^1,10. Во время ETD эритробласты подвергаются трем-пяти матурационным клеточным делениям, прежде чем энуклеироваться с образованием ретикулоцитов, которые созревают в красные клетки.

Эритробласты во время терминальной дифференцировки были первоначально классифицированы на основе их морфологии на проэритробласты, базофильные, полихроматические и ортохроматические. Появление проточной цитометрии позволило провести их перспективную сортировку и выделение на основе размера ячейки (измеренного прямым рассеянием, FSC) и двух маркеров поверхности клеток, CD71 и Ter119 11,12,13 (рисунок 1). Этот и подобные им проточные цитометрические подходы¹⁴ произвели революцию в исследовании молекулярных и клеточных аспектов ETD, позволив проводить специфический для стадии развития эритробластов in vivo и in vitro 10,15,16,17,18,19,20. Подход CD71/Ter119 в настоящее время регулярно используется при анализе предшественников эритроида.

До недавнего времени аналогичный, доступный проточный цитометрический подход для прямой перспективной изоляции КОЕ-е и БФУ-е из ткани мыши ускользал от исследователей. Вместо этого исследователи использовали проточные цитометрические стратегии, которые изолируют только часть этих предшественников, часто в присутствии неэритроидных клеток, которые совместно очищаются в пределах одного и того же проточного цитометрического подмножества²¹. Следовательно, исследование BFU-e и CFU-e было ограничено системами дифференцировки in vitro, которые получают и амплируют BFU-e и CFU-e от более ранних предшественников костного мозга. Затем можно применить проточные цитометрические стратегии, которые отличают КОЕ-е от БФУ-е в этих эритроидных культурах, обогащенных предшественниками^22,23. Альтернативный подход использует фетальные КОЕ-е и БФУ-е, которые высоко обогащены в Ter119-отрицательной фракции печени плода мыши в середине беременности 10,24,25. Ни один из этих подходов, однако, не позволяет исследовать взрослые BFU-e и CFU-e в их физиологическом состоянии in vivo. Величину проблемы можно оценить, если напомнить, что, основываясь на анализах колониеобразования, эти клетки присутствуют во взрослом костном мозге с частотой всего 0,025% и 0,3% соответственно⁶.

Протокол, описанный здесь, представляет собой новый проточный цитометрический подход, основанный на одноклеточном транскриптомном анализе свежесобранных клеток костного мозга мыши Kit⁺ (Kit экспрессируется всеми ранними популяциями-предшественниками костного мозга)¹. Наш подход содержит некоторые маркеры клеточной поверхности, которые уже использовались Pronk et ^al.21,26. Одноклеточные транскриптомы использовались для определения комбинаций маркеров клеточной поверхности, которые идентифицируют эритроидные и другие ранние кроветворные предшественники (рисунок 2). В частности, фракция CD55⁺ линейно-отрицательных (Lin^–) клеток Kit⁺ может быть подразделена на пять популяций, три из которых дают смежные сегменты траектории эритроида (рисунок 2). Транскриптомные идентичности каждой из этих популяций были подтверждены сортировкой, за которой последовал scRNAseq и проекция отсортированных одноклеточных транскриптомов обратно на исходную транскриптомную карту (экспрессия генов в каждой из пяти популяций и весь набор данных костного мозга могут быть изучены в https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . Потенциал судьбы клеток каждой из популяций был подтвержден с использованием традиционных анализов формирования колоний (рисунок 2), а также нового высокопроизводительного анализа судьбы одноклеточных^{клеток 1,27}. Эти анализы показывают, что новый проточный цитометрический подход приводит к высокочистой изоляции всех предшественников BFU-e и CFU-e свежих взрослых костного мозга и селезенки. В частности, популяция 1 (P1) содержит только КОЕ-е и никаких других кроветворных предшественников, а популяция 2 (Р2) содержит все предшественники BFU-e костного мозга и небольшое количество КОЕ-е, но не содержит других прародителей¹. Подробный протокол ниже дополнительно проиллюстрирован примером эксперимента на мышах, которым вводили либо физиологический раствор, либо эритропоэз-стимулирующий гормон эритропоэтин (Эпо).