फ्लो साइटोमेट्री द्वारा माउस ऊतक से बर्स्ट-फॉर्मिंग यूनिट और कॉलोनी बनाने वाली यूनिट एरिथ्रोइड पूर्वजों की पहचान और अलगाव
Summary
यहां, हम ताजा माउस अस्थि मज्जा और प्लीहा से सीधे प्रारंभिक विस्फोट बनाने वाली इकाई एरिथ्रोइड (बीएफयू-ई) और कॉलोनी बनाने वाली इकाई एरिथ्रोइड (सीएफयू-ई) पूर्वजों के संभावित अलगाव के लिए एक नवीन प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि का वर्णन करते हैं। एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा के आधार पर विकसित यह प्रोटोकॉल, उच्च शुद्धता वाले सभी ऊतक के एरिथ्रोइड पूर्वजों को अलग करने वाला पहला है।
Abstract
प्रारंभिक एरिथ्रोइड पूर्वजों को मूल रूप से विट्रो में उनकी कॉलोनी बनाने की क्षमता द्वारा परिभाषित किया गया था और बीएफयू-ई और सीएफयू-ई के रूप में जाना जाने वाला विस्फोट-निर्माण और कॉलोनी बनाने वाली “इकाइयों” में वर्गीकृत किया गया था। कुछ समय पहले तक, ताजा पृथक वयस्क माउस अस्थि मज्जा से शुद्ध बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों के प्रत्यक्ष संभावित और पूर्ण अलगाव के तरीके उपलब्ध नहीं थे। इस अंतर को संबोधित करने के लिए, सेल सतह मार्करों के लिए जीन कोडिंग की अभिव्यक्ति के लिए माउस अस्थि मज्जा के एक एकल-सेल आरएनए-सेक (एससीआरएनएसेक) डेटासेट का विश्लेषण किया गया था। इस विश्लेषण को सेल भाग्य परख के साथ जोड़ा गया था, जिससे एक नए प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण के विकास की अनुमति मिली जो माउस अस्थि मज्जा या प्लीहा में बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों के पूर्ण और शुद्ध उपसमुच्चय की पहचान और अलगाव की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण अन्य पूर्वज उप-समूहों की भी पहचान करता है, जिसमें बेसोफिल / मस्तूल सेल और मेगाकैरियोसाइटिक क्षमता के लिए समृद्ध उपसमुच्चय शामिल हैं। विधि में किट और सीडी 55 पर निर्देशित एंटीबॉडी के साथ ताजा अस्थि मज्जा या प्लीहा कोशिकाओं को लेबल करना शामिल है। पूर्वज जो इन दोनों मार्करों को व्यक्त करते हैं, उन्हें तब पांच प्रमुख आबादी में विभाजित किया जाता है। जनसंख्या 1 (पी 1 या सीएफयू-ई, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / कम सीडी 105मेड / उच्च सीडी 71मेड / उच्च) में सभी सीएफयू-ई पूर्वज शामिल हैं और इसे आगे पी 1-लो (सीडी 71मेड सीडी 150उच्च) और पी 1-हाय (सीडी 71उच्च सीडी 150कम) में विभाजित किया जा सकता है, जो क्रमशः प्रारंभिक और देर से सीएफयू-ई के अनुरूप है; जनसंख्या 2 (पी 2 या बीएफयू-ई, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / कम सीडी 105मेड / उच्च सीडी 71कम सीडी 150उच्च) में सभी बीएफयू-ई पूर्वज शामिल हैं; जनसंख्या पी 3 (पी 3, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / उच्च सीडी 105मेड / कम सीडी 150कम सीडी 41कम) बेसोफिल / मास्ट सेल पूर्वजों के लिए समृद्ध है; जनसंख्या 4 (पी 4, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / उच्च सीडी 105मेड / कम सीडी 150उच्च सीडी 41 +) मेगाकैरियोसाइटिक पूर्वजों के लिए समृद्ध है; और जनसंख्या 5 (पी 5, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / उच्च सीडी 105मेड / कम सीडी 150उच्च सीडी 41–) में एरिथ्रोइड, बेसोफिल / मास्ट सेल, और मेगाकैरियोसाइटिक क्षमता (ईबीएमपी) और एरिथ्रोइड / मेगाकैरियोसाइटिक / बेसोफिल-पक्षपाती मल्टीपोटेंशियल पूर्वजों (एमपीपी) के साथ पूर्वज शामिल हैं। यह नया दृष्टिकोण एरिथ्रोइड और अन्य हेमटोपोइएटिक पूर्वजों का विश्लेषण करते समय अधिक सटीकता की अनुमति देता है और प्रत्येक प्रवाह साइटोमेट्रिक रूप से परिभाषित आबादी के लिए ट्रांसस्क्रिप्टम जानकारी के संदर्भ की भी अनुमति देता है।
Introduction
एरिथ्रोपोएसिस को दो प्रमुख चरणों में विभाजित किया जा सकता है: प्रारंभिक एरिथ्रोपोएसिस और एरिथ्रोइड टर्मिनल भेदभाव (चित्रा 1)1,2,3। प्रारंभिक एरिथ्रोपोएसिस में, हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाएं एरिथ्रोइड वंश के लिए प्रतिबद्ध होती हैं और प्रारंभिक एरिथ्रोइड पूर्वजों को जन्म देती हैं, जिन्हें पहली बार 1970 के दशक में अर्ध-ठोस माध्यम 4,5,6,7,8,9 में उनकी कॉलोनी बनाने की क्षमता के आधार पर पहचाना गया था . मोटे तौर पर, एरिथ्रोइड पूर्वजों को दो श्रेणियों में विभाजित किया जाता है: पहले पूर्वज जो प्रत्येक “फट” (छोटे एरिथ्रोइड सेल क्लस्टर का एक बड़ा समुच्चय) को जन्म देते हैं, जिन्हें “बर्स्ट-फॉर्मिंग यूनिट एरिथ्रोइड” या बीएफयू-ई 4,5,6 कहा जाता है; और उनकी संतान, जो प्रत्येक एक एकल, छोटे एरिथ्रोइड सेल क्लस्टर या कॉलोनी का निर्माण करती है, जिसे “कॉलोनी बनाने वाली इकाई एरिथ्रोइड” या सीएफयू-ई 7,8,9 नाम दिया जाता है। BFU-e और CFU-e अभी तक टर्मिनल एरिथ्रोइड जीन व्यक्त नहीं करते हैं और रूपात्मक रूप से पहचानने योग्य नहीं हैं। कई स्व-नवीकरण या विस्तार कोशिका विभाजनों के बाद, सीएफयू-ई एक ट्रांसक्रिप्शनल स्विच से गुजरता है जिसमें ग्लोबिन जैसे एरिथ्रोइड जीन प्रेरित होते हैं, जिससे एरिथ्रोइड टर्मिनल भेदभाव (ईटीडी) 1,10 में संक्रमण होता है। ईटीडी के दौरान, एरिथ्रोब्लास्ट रेटिकुलोसाइट्स बनाने के लिए एन्यूक्लिएटिंग से पहले तीन से पांच परिपक्वता कोशिका विभाजन से गुजरते हैं, जो लाल कोशिकाओं में परिपक्व होते हैं।
टर्मिनल भेदभाव के दौरान एरिथ्रोब्लास्ट्स को मूल रूप से उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर प्रोएरिथ्रोब्लास्ट्स, बेसोफिलिक, पॉलीक्रोमैटिक और ऑर्थोक्रोमैटिक में वर्गीकृत किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री के आगमन ने सेल आकार (फॉरवर्ड स्कैटर, एफएससी द्वारा मापा गया) और दो सेल सतह मार्करों, सीडी 71 और टेर 119 11,12,13 (चित्रा 1) के आधार पर उनकी संभावित छंटाई और अलगाव की अनुमति दी। इस और इसी तरह के प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण14 ने ईटीडी के आणविक और सेलुलर पहलुओं की जांच में क्रांति ला दी है, जिससे विवो और इन विट्रो10,15,16,17,18,19,20 में एरिथ्रोब्लास्ट्स के विकास चरण-विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति मिलती है। CD71/Ter119 दृष्टिकोण अब एरिथ्रोइड अग्रदूतों के विश्लेषण में नियमित रूप से उपयोग किया जाता है।
हाल तक, माउस ऊतक से सीएफयू-ई और बीएफयू-ई के प्रत्यक्ष, उच्च शुद्धता वाले संभावित अलगाव के लिए एक समान, सुलभ प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण जांचकर्ताओं से दूर रहा है। इसके बजाय, जांचकर्ताओं ने प्रवाह साइटोमेट्रिक रणनीतियों का उपयोग किया है जो इन पूर्वजों के केवल एक अंश को अलग करते हैं, अक्सर गैर-एरिथ्रोइड कोशिकाओं की उपस्थिति में जो एक ही प्रवाह साइटोमेट्रिक उपसमुच्चय21 के भीतर सह-शुद्ध होते हैं। नतीजतन, बीएफयू-ई और सीएफयू-ई की जांच इन विट्रो भेदभाव प्रणालियों तक सीमित थी जो पहले के अस्थि मज्जा पूर्वजों से बीएफयू-ई और सीएफयू-ई को प्राप्त और बढ़ाते हैं। फिर प्रवाह साइटोमेट्रिक रणनीतियों को लागू करना संभव है जो इन एरिथ्रोइड पूर्वज-समृद्ध संस्कृतियों में सीएफयू-ई को बीएफयू-ई से अलग करते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण भ्रूण सीएफयू-ई और बीएफयू-ई का उपयोग करता है, जो मध्य गर्भधारण 10,24,25 में माउस भ्रूण के यकृत के टेर119-नकारात्मक अंश में अत्यधिक समृद्ध होते हैं। हालांकि, इनमें से कोई भी दृष्टिकोण विवो में अपनी शारीरिक स्थिति में वयस्क बीएफयू-ई और सीएफयू-ई की जांच की अनुमति नहीं देता है। चुनौती की भयावहता की सराहना की जा सकती है जब याद किया जा सकता है कि, कॉलोनी गठन परख के आधार पर, ये कोशिकाएं वयस्क अस्थि मज्जामें क्रमशः केवल 0.025% और 0.3% की आवृत्ति पर मौजूद हैं।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल ताजा काटे गए किट + माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं के एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के आधार पर एक नया प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण है (किट अस्थि मज्जा के सभी शुरुआती पूर्वज आबादी द्वारा व्यक्त किया जाता है)1। हमारे दृष्टिकोण में कुछ सेल सतह मार्कर शामिल हैं जो पहले से ही Pronk et al.21,26 द्वारा उपयोग में थे। एकल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टम का उपयोग सेल सतह मार्करों के संयोजन को निर्धारित करने के लिए किया गया था जो एरिथ्रोइड और अन्य प्रारंभिक हेमटोपोइएटिक पूर्वजों की पहचान करते हैं (चित्रा 2)। विशेष रूप से, वंश-नकारात्मक (लिन-) किट + कोशिकाओं के सीडी 55+ अंश को पांच आबादी में विभाजित किया जा सकता है, जिनमें से तीन एरिथ्रोइड प्रक्षेपवक्र (चित्रा 2) के सन्निहित खंड उत्पन्न करते हैं। इन आबादी में से प्रत्येक की ट्रांसक्रिप्टोमिक पहचान की पुष्टि छंटाई द्वारा की गई थी, इसके बाद एससीआरएनएसेक और क्रमबद्ध एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टम के प्रक्षेपण को मूल ट्रांसक्रिप्टोमिक मानचित्र पर वापस लाया गया (पांच आबादी में से प्रत्येक में जीन अभिव्यक्ति और पूरे अस्थि-मज्जा डेटासेट को https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html में खोजा जा सकता है)1 . प्रत्येक आबादी की सेल भाग्य क्षमता की पुष्टि पारंपरिक कॉलोनी गठन परख (चित्रा 2) का उपयोग करके की गई थी, साथ ही साथ एक उपन्यास उच्च-थ्रूपुट एकल-सेल भाग्य परख 1,27 भी थी। इन विश्लेषणों से पता चलता है कि नए प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप ताजा वयस्क अस्थि मज्जा और प्लीहा के सभी बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों का उच्च शुद्धता अलगाव होता है। विशेष रूप से, जनसंख्या 1 (पी 1) में केवल सीएफयू-ई और कोई अन्य हेमटोपोइएटिक पूर्वज नहीं होते हैं, और जनसंख्या 2 (पी 2) में अस्थि मज्जा के सभी बीएफयू-ई पूर्वज और सीएफयू-ई की एक छोटी संख्या होती है लेकिन कोई अन्य पूर्वज नहींहोता है। नीचे दिए गए विस्तृत प्रोटोकॉल को चूहों में एक उदाहरण प्रयोग के साथ चित्रित किया गया है जिन्हें या तो खारा या एरिथ्रोपोएसिस-उत्तेजक हार्मोन एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ) के साथ इंजेक्ट किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च शुद्धता वाले ताजा ऊतक से सीधे बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों को भावी प्रभाव से अलग करने की क्षमता पहले जांचकर्ताओं से दूर थी। हमारा नया दृष्टिकोण, जिसे scRNAseq और सेल भाग्य परख 1,27 का उपयोग क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच अनुदान R01DK130498, R01DK120639, और R01HL141402 द्वारा समर्थित है
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
Referências
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