Identifikation og isolering af burstdannende enhed og kolonidannende enhed erythroid-forfædre fra musevæv ved flowcytometri

Erythropoiesis kan opdeles i to hovedfaser: tidlig erythropoiesis og erythroid terminal differentiering (figur 1)^1,2,3. I tidlig erythropoiesis forpligter hæmatopoietiske stamceller sig til erythroid-slægten og giver anledning til tidlige erythroid-forfædre, som først blev identificeret i 1970’erne baseret på deres kolonidannende potentiale i halvfast medium 4,5,6,7,8,9 . Generelt er erythroid-forfædre opdelt i to kategorier: tidligere forfædre, der hver giver anledning til en “burst” (et stort aggregat af mindre erythroidcelleklynger), kaldet “burst-forming unit erythroid” eller BFU-e ^4,5,6; og deres afkom, som hver danner en enkelt, lille erythroidcelleklynge eller koloni, kaldet “kolonidannende enhed erythroid” eller CFU-e ^7,8,9. BFU-e og CFU-e udtrykker endnu ikke terminale erythroidgener og er ikke morfologisk genkendelige. Efter en række selvfornyelses- eller ekspansionscelledelinger gennemgår CFU-e en transkriptionskontakt, hvor erythroidgener såsom globiner induceres og derved overgår til erythroid terminal differentiering (ETD)^1,10. Under ETD gennemgår erythroblaster tre til fem modningscelledelinger, før de enukleerer til dannelse af reticulocytter, som modnes til røde blodlegemer.

Erythroblaster under terminal differentiering blev oprindeligt klassificeret baseret på deres morfologi i proerythroblaster, basofile, polykromatiske og ortokromatiske. Fremkomsten af flowcytometri tillod deres prospektive sortering og isolering baseret på cellestørrelse (målt ved fremadspredning, FSC) og to celleoverflademarkører, CD71 og Ter119^11,12,13 (figur 1). Denne og lignende flowcytometriske tilgange 14 har revolutioneret undersøgelsen af de molekylære og cellulære aspekter af ETD, hvilket muliggør udviklingsfasespecifik analyse af erythroblaster in vivo og in vitro 10,15,16,17,18,19,20. CD71/Ter119-tilgangen anvendes nu rutinemæssigt i analysen af erythroidprækursorer.

Indtil for nylig har en lignende, tilgængelig flowcytometrisk tilgang til direkte prospektiv isolering af CFU-e og BFU-e med høj renhed fra musevæv undgået efterforskere. I stedet har efterforskere brugt flowcytometriske strategier, der kun isolerer en brøkdel af disse forfædre, ofte i nærvær af ikke-erythroidceller, der co-renser inden for de samme flowcytometriske undergrupper²¹. Derfor var undersøgelsen af BFU-e og CFU-e begrænset til de vitro-differentieringssystemer, der udleder og forstærker BFU-e og CFU-e fra tidligere knoglemarvsprogenitorer. Det er derefter muligt at anvende flowcytometriske strategier, der adskiller CFU-e fra BFU-e i disse erythroide stamfaderberigede kulturer^22,23. En alternativ tilgang gør brug af føtal CFU-e og BFU-e, som er højt beriget i den Ter119-negative fraktion af museføtal lever midt i drægtigheden 10,24,25. Ingen af disse fremgangsmåder tillader imidlertid undersøgelse af voksne BFU-e og CFU-e i deres fysiologiske tilstand in vivo. Udfordringens størrelse kan forstås, når man husker, at disse celler baseret på kolonidannelsesanalyser er til stede i den voksne knoglemarv med en frekvens på kun 0,025% og 0,3% henholdsvis⁶.

Protokollen beskrevet her er en ny flowcytometrisk tilgang baseret på enkeltcelletranskriptomisk analyse af nyhøstede Kit⁺ museknoglemarvsceller (Kit udtrykkes af alle de tidlige stamfaderpopulationer i knoglemarven)¹. Vores tilgang indeholder nogle celleoverflademarkører, der allerede var i brug af Pronk et ^al.21,26. Enkeltcelletranskriptomer blev brugt til at bestemme kombinationer af celleoverflademarkører, der identificerer erythroid og andre tidlige hæmatopoietiske forfædre (figur 2). Specifikt kan CD55+ fraktionen af afstamningsnegative (Lin^–) Kit⁺ celler opdeles i fem populationer, hvoraf tre giver sammenhængende segmenter af erythroidbanen (figur 2). De transkriptomiske identiteter af hver af disse populationer blev bekræftet ved sortering efterfulgt af scRNAseq og projektion af de sorterede enkeltcelletranskriptomer tilbage på det oprindelige transkriptomiske kort (genekspressionen i hver af de fem populationer og hele knoglemarvsdatasættet kan udforskes i https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . Celleskæbnepotentialet for hver af populationerne blev bekræftet ved hjælp af traditionelle kolonidannelsesassays (figur 2) samt et nyt enkeltcelleskæbneassay med høj kapacitet ^1,27. Disse analyser viser, at den nye flowcytometriske tilgang resulterer i isolering med høj renhed af alle BFU-e- og CFU-e-forfædre til frisk voksen knoglemarv og milt. Specifikt indeholder population 1 (P1) kun CFU-e og ingen andre hæmatopoietiske forfædre, og population 2 (P2) indeholder alle knoglemarvens BFU-e-forfædre og et lille antal CFU-e, men ingen andre forfædre¹. Den detaljerede protokol nedenfor illustreres yderligere med et eksempelforsøg på mus, der blev injiceret med enten saltvand eller med det erythropoiesestimulerende hormon erythropoietin (Epo).