यहां, एक नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर सिस्टम को परिभाषित वक्रता के साथ सिंथेटिक झिल्ली प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है जो विट्रो में वक्रता संवेदन क्षमता के साथ प्रोटीन के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है।
झिल्ली वक्रता कोशिकाओं की विभिन्न आवश्यक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जैसे कि कोशिका प्रवास, कोशिका विभाजन और पुटिका तस्करी। यह न केवल सेलुलर गतिविधियों द्वारा निष्क्रिय रूप से उत्पन्न होता है, बल्कि सक्रिय रूप से प्रोटीन इंटरैक्शन को भी नियंत्रित करता है और कई इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग में शामिल होता है। इस प्रकार, प्रोटीन और लिपिड के वितरण और गतिशीलता को विनियमित करने में झिल्ली वक्रता की भूमिका की जांच करना बहुत महत्वपूर्ण है। हाल ही में, विट्रो में घुमावदार झिल्ली और प्रोटीन के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है। पारंपरिक तकनीकों की तुलना में, नव विकसित नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) पूर्व-परिभाषित झिल्ली वक्रता और स्थानीय फ्लैट नियंत्रण के साथ नैनोबार के पैटर्न सरणी पर एक निरंतर लिपिड बाइलेयर बनाकर झिल्ली वक्रता पीढ़ी में उच्च-थ्रूपुट और बेहतर सटीकता दोनों प्रदान करता है। घुमावदार झिल्ली के लिए लिपिड तरलता और प्रोटीन संवेदनशीलता दोनों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग करके मात्रात्मक रूप से विशेषता दी जा सकती है। यहां, नैनोबार सरणियों वाले निर्मित कांच की सतहों पर एसएलबी बनाने और ऐसे एसएलबी पर वक्रता-संवेदनशील प्रोटीन के लक्षण वर्णन पर एक विस्तृत प्रक्रिया पेश की गई है। इसके अलावा, नैनोचिप पुन: उपयोग और छवि प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल कवर किए गए हैं। नैनोबार-एसएलबी से परे, यह प्रोटोकॉल वक्रता संवेदन अध्ययन के लिए सभी प्रकार के नैनोस्ट्रक्चर्ड ग्लास चिप्स पर आसानी से लागू होता है।
मेम्ब्रेन वक्रता एक कोशिका का एक महत्वपूर्ण भौतिक पैरामीटर है जो विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे मॉर्फोजेनेसिस, सेल डिवीजन और सेल माइग्रेशन1 में होता है। अब यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि झिल्ली वक्रता सेलुलर घटनाओं के एक साधारण परिणाम से परे है; इसके बजाय, यह प्रोटीन इंटरैक्शन और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग के एक प्रभावी नियामक के रूप में उभरा है। उदाहरण के लिए, क्लैथ्रिन-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस में शामिल कई प्रोटीन अधिमानतः घुमावदार झिल्ली से बंधे हुए पाए गए, जिसके परिणामस्वरूप एंडोसाइटोसिस2 के लिए एक हॉटस्पॉट का गठन हुआ। झिल्ली विरूपण के कई अलग-अलग कारण हैं जैसे साइटोस्केलेटल बलों द्वारा झिल्ली खींचना, विभिन्न आकार के सिर समूहों के साथ लिपिड विषमता की उपस्थिति, शंक्वाकार आकार के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का अस्तित्व, बीएआर-डोमेन प्रोटीन (बिन, एम्फीफिसिन और आरवीएस प्रोटीन के नाम पर) जैसे झिल्ली को आकार देने वाले प्रोटीन का संचय, और झिल्ली में एम्फीपैथिक हेलिकॉप्टर डोमेन का सम्मिलन1 . दिलचस्प बात यह है कि ये प्रोटीन और लिपिड न केवल झिल्ली को विकृत करते हैं, बल्कि झिल्ली वक्रता को भी महसूस कर सकते हैं और अधिमान्य संचय प्रदर्शित करसकते हैं। इसलिए, यह अध्ययन करना महत्वपूर्ण है कि क्या और कैसे विभिन्न वक्रता वाले झिल्ली उनसे जुड़े प्रोटीन और लिपिड के वितरण और गतिशीलता को बदलते हैं और संबंधित इंट्रासेल्युलर प्रक्रियाओं पर संभावित प्रभाव डालते हैं।
जीवित कोशिका और इन विट्रो सिस्टम दोनों में घुमावदार झिल्ली और प्रोटीन के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है। लाइव सेल सिस्टम समृद्ध लिपिड विविधता और गतिशील प्रोटीन सिग्नलिंग विनियमन 2,3,4,5,6,7 के साथ एक वास्तविक सेल वातावरण प्रदान करता है। हालांकि, इंट्रासेल्युलर वातावरण में अनिश्चितताओं और उतार-चढ़ाव के कारण इस तरह की परिष्कृत प्रणाली का अध्ययन करना मुश्किल है। इसलिए, ज्ञात लिपिड प्रजातियों और शुद्ध प्रोटीन से बने कृत्रिम झिल्ली का उपयोग करके इन विट्रो परख प्रोटीन और घुमावदार झिल्ली के बीच संबंधों को चिह्नित करने के लिए शक्तिशाली पुनर्गठन प्रणाली बन गए हैं। परंपरागत रूप से, विभिन्न व्यास के लिपोसोम एक्सट्रूज़न द्वारा उत्पन्न होते हैं ताकि या तो केन्द्रापसारक बल का उपयोग करके सह-अवसादन परख या प्रोटीन एकत्रीकरण 8,9 से बचने के लिए घनत्व ढाल के साथ सह-प्लवनशीलता परख के माध्यम से वक्रता-संवेदनशील प्रोटीन का पता लगाया जा सके। हालांकि, एक्सट्रूडेड लिपोसोम की वक्रता एक्सट्रूडर10 में उपयोग किए जाने वाले झिल्ली फिल्टर के उपलब्ध छिद्र आकार से सीमित है। एकल लिपोसोम वक्रता (एसएलआईसी) परख इस सीमा को दूर करने के लिए साबित हुई है, जिसमें विभिन्न व्यास वाले लिपोसोम को फ्लोरेसेंस-लेबल किया जाता है और सतह पर स्थिर किया जाता है ताकि वक्रता को फ्लोरोसेंट तीव्रता11 द्वारा चिह्नित किया जा सके। हालांकि, छोटे पुटिकाओं में लिपिड संरचना में मजबूत परिवर्तनशीलता देखी गई है, जो वक्रता माप12 की सटीकता को प्रभावित करती है। टीथर-पुलिंग प्रयोग ऑप्टिकल ट्वीज़र का उपयोग करके विशाल यूनिलैमेलर पुटिकाओं (जीयूवी) से खींचे गए क्षणिक टेथर पर वक्रता का अधिक सटीक माप प्रदान करते हैं, जहां वक्रता को13,14 उत्पन्न झिल्ली तनाव द्वारा अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। यह विधि सकारात्मक या नकारात्मक-वक्रता संवेदन प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन ट्यूब पीढ़ी10 के थ्रूपुट द्वारा बाधित है। समर्थित झिल्ली ट्यूब (एसएमआरटी) परख कई झिल्ली ट्यूबों की एक साथ पीढ़ी को वहन करती है जो माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह द्वारा एक ही लिपिड जलाशय से बाहर निकाले जाते हैं। फिर भी, झिल्ली वक्रता नैनोट्यूब के साथ आंतरिक रूप से भिन्न होती है, जो प्रतिदीप्ति-तीव्रता-आधारित वक्रता माप15,16 की सटीकता से समझौता करती है। इसकी तुलना में, डिजाइन किए गए टोपोग्राफी वाली सतहों पर एक समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) बनाने के लिए छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एसयूवी, व्यास <100 एनएम 17) का उपयोग करके उच्च सटीकता 18,19,20 में नैनोफैब्रिकेशन या नैनोमैटेरियल्स द्वारा पूर्व निर्धारित वक्रता के साथ एक एकल बाईलेयर झिल्ली उत्पन्न हुई।
यहां, हम नैनोबार सरणियों के साथ निर्मित नैनोचिप सतहों पर एसएलबी के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और इसका उपयोग विट्रो में प्रोटीन की वक्रता संवेदनशीलता की जांच के लिए कैसे किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, परख के छह आवश्यक घटक हैं: ए) माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के साथ चिप की सफाई और असेंबली; बी) परिभाषित लिपिड संरचना के साथ एसयूवी की तैयारी; सी) नैनोचिप पर एसएलबी का गठन और वक्रता संवेदनशील प्रोटीन के साथ बंधन; डी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत एसएलबी और वक्रता संवेदनशील प्रोटीन की इमेजिंग और लक्षण वर्णन; ई) पुन: उपयोग के लिए चिप की सफाई; च) प्रोटीन वक्रता संवेदन क्षमता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवि प्रसंस्करण। विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे चरण-दर-चरण वर्णित है।
यहां वर्णित नैनोबार-एसएलबी प्रणाली कई मौजूदा इन विट्रो परखों में फायदे का एक अनूठा संयोजन प्रदान करती है। यह कुशलतापूर्वक लिपोसोम फ्लोटेशन या अवसादन परख के रूप में अत्यधिक घुमावदार झिल्ली के लिए …
The authors have nothing to disclose.
हम नैनोस्ट्रक्चर फैब्रिकेशन और एसईएम इमेजिंग का समर्थन करने के लिए नानयांग टेक्नोलॉजिकल यूनिवर्सिटी (एनटीयू) में नानयांग नैनोफैब्रिकेशन सेंटर (एन 2 एफसी) और सेंटर फॉर डिसरप्टिव फोटोनिक टेक्नोलॉजीज (सीडीपीटी), प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज एनटीयू में प्रोटीन प्रोडक्शन प्लेटफॉर्म (पीपीपी) और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए स्कूल ऑफ केमिकल एंड बायोमेडिकल इंजीनियरिंग एनटीयू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय (एमओई) (डब्ल्यू झाओ, आरजी 112/20, आरजी 95/21, और एमओई-टी 2ईपी 30220-0009), इंस्टीट्यूट फॉर डिजिटल मॉलिक्यूलर एनालिटिक्स एंड साइंस (आईडीएमएक्सएस) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, जो रिसर्च सेंटर ऑफ एक्सीलेंस स्कीम (डब्ल्यू झाओ), ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम फाउंडेशन (डब्ल्यू झाओ, आरजीवाई0088/2021) के तहत एमओई फंडिंग द्वारा समर्थित है। अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए स्कूल ऑफ केमिकल एंड बायोमेडिकल इंजीनियरिंग एनटीयू (एक्स मियाओ), और अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद (जे वू)।
Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
Cotton buds | Watsons | ||
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
MATLAB | Mathworks | R2018b | |
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
Voterx | Scientific Industries | G560E | |
Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
Water Bath | Julabo | TW8 |