Detta protokoll beskriver differentieringsprocessen av humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) till mikroglialiknande celler för in vitro-experiment. Vi inkluderar också en detaljerad procedur för att generera humana synaptosomer från iPSC-härledda lägre motorneuroner som kan användas som ett substrat för in vitro-fagocytosanalyser med hjälp av levande cellavbildningssystem.
Microglia är de bosatta immuncellerna av myeloiskt ursprung som upprätthåller homeostas i hjärnans mikromiljö och har blivit en nyckelspelare i flera neurologiska sjukdomar. Att studera mänsklig mikroglia i hälsa och sjukdom utgör en utmaning på grund av den extremt begränsade tillgången på mänskliga celler. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) som härrör från mänskliga individer kan användas för att kringgå denna barriär. Här demonstreras hur man kan differentiera humana iPSC till mikroglialiknande celler (iMG) för in vitro-experiment . Dessa iMGs uppvisar de förväntade och fysiologiska egenskaperna hos microglia, inklusive mikroglialiknande morfologi, uttryck av korrekta markörer och aktiv fagocytos. Dessutom tillhandahålls dokumentation för isolering och märkning av synaptosomsubstrat härledda från humana iPSC-härledda lägre motorneuroner (i3LMN). En live-cell, longitudinell avbildningsanalys används för att övervaka uppslukandet av humana synaptosomer märkta med ett pH-känsligt färgämne, vilket möjliggör undersökningar av iMG: s fagocytiska kapacitet. Protokollen som beskrivs häri är i stort sett tillämpliga på olika områden som undersöker mänsklig mikrogliabiologi och mikroglias bidrag till sjukdom.
Microglia är de inneboende immuncellerna i centrala nervsystemet (CNS) och spelar en avgörande roll för att utveckla CNS. Microglia är också viktiga i den vuxna hjärnan för att upprätthålla homeostas och aktivt svara på trauma och sjukdomsprocesser. Kumulativa bevis visar att mikroglia är viktiga bidragsgivare till patogenesen av flera neuroutvecklings- och neurodegenerativa sjukdomar 1,2. Även om nuvarande kunskap om mikroglialbiologi huvudsakligen har härletts från musmodeller, har nyligen genomförda studier belyst viktiga skillnader mellan murin och mänsklig mikroglia, vilket understryker behovet av att utveckla teknik för att studera genetik och biologiska funktioner hos mänsklig mikroglia 3,4. Isolering av mikroglia från dissekerad primärvävnad kan allvarligt modifiera mikrogliaegenskaper5, vilket potentiellt förvirrar resultat som erhållits med sådana celler. Det övergripande målet med denna metod är att differentiera humana iPSC till iMGs och därigenom tillhandahålla ett cellodlingssystem för att studera human mikroglia under basala förhållanden. Dessutom ingår en fagocytosanalys med ett helt mänskligt modellsystem häri som ett sätt att studera funktionaliteten hos iMGs, både som ett kvalitetskontrollmått och för att bedöma iMG-dysfunktion i samband med sjukdom.
Flera protokoll för mikrogliadifferentiering från iPSC har nyligen dykt upp i litteraturen 6,7,8,9,10. Potentiella nackdelar med vissa protokoll inkluderar förlängda eller långa perioder av differentiering, tillägg av flera tillväxtfaktorer och / eller komplexa experimentella förfaranden 6,9,10. Här demonstreras en “användarvänlig” differentieringsmetod som rekapitulerar aspekter av mikroglia-ontogeni genom differentiering av iPSC till prekursorceller som kallas primitiva makrofagprekursorer (PMP)7,11. PMP: er genereras som beskrivits tidigare, med vissa optimeringar som presenteras häri12. PMP: erna efterliknar MYB-oberoende äggula-sac-härledda makrofager, som ger upphov till mikroglia under embryonal utveckling genom att invadera hjärnan innan blod-hjärnbarriären stängs13. För att terminalt differentiera PMP till iMGs använde vi en snabb och förenklad monokulturmetod baserad på protokoll från Haenseler et al. och Brownjohn et al., med vissa modifieringar för att generera en effektiv mikrogliadifferentieringsmetod där iMGs robust uttrycker mikrogliaberikade markörer 7,8. Denna differentieringsmetod kan reproduceras i laboratorier med expertis inom iPSC: s kultur och med forskningsmål som syftar till att studera mikrogliabiologi med hjälp av ett mänskligt modellsystem.
iPSC-härledd mikroglia representerar en biologiskt relevant källa till human mikroglia för in vitro-experiment och är ett viktigt verktyg för att undersöka mikrogliala kanoniska funktioner, inklusive fagocytos. Microglia är de professionella fagocyterna i hjärnan och CNS, där de rensar cellskräp, aggregerade proteiner och nedbrutet myelin14. Microglia fungerar också vid synaptisk ombyggnad genom att uppsluka synapser och i försvaret mot yttre infektioner genom fagocytos av patogener15,16. I detta protokoll bedöms fagocytos av iMGs med användning av humana synaptosomer som material för iMG-uppslukande. För detta ändamål beskrivs en beskrivning för isolerande synaptosomer härledda från humana i3LMN. De i3LMN-härledda humana synaptosomerna är märkta med ett pH-känsligt färgämne som möjliggör kvantifiering av synaptosomer lokaliserade i sura fack under fagosombearbetning och nedbrytning in vitro. En fagocytosanalys med hjälp av levande cellmikroskopi visas för att övervaka den dynamiska processen för mikroglia-uppslukande i realtid. Denna funktionella analys skapar en grund för att undersöka eventuella defekter i mikroglial fagocytos i hälsa och sjukdom med hjälp av ett komplett mänskligt system.
Differentieringsprotokollet som beskrivs här ger en effektiv metod för att erhålla iPSC-härledda mikroglialiknande celler på ~ 6-8 veckor med hög renhet och i ett tillräckligt utbyte för att utföra immunofluorescensexperiment och andra analyser som kräver ett högre antal celler. Detta protokoll har gett upp till 1 × 106 iMG på 1 vecka, vilket möjliggör protein- och RNA-extraktion och motsvarande nedströmsanalyser (t.ex. RNASeq, qRT-PCR, western blot, masspektrometri). Som sagt, en begränsning …
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Michael Ward för att ha tillhandahållit WTC11 hNIL iPSC-linjen för motorneurondifferentiering och Jackson Laboratories för att leverera KOLF2.1J WT-klon B03 iPSC-linjen som används för mikrogliadifferentiering. Vi tackar också Dorothy Schafer för hennes stöd under implementeringen av protokollen, Anthony Giampetruzzi och John Landers för deras hjälp med live-cell imaging system samt Hayden Gadd för hans tekniska bidrag under revisioner och Jonathan Jung för hans samarbete i denna studie. Detta arbete stöddes av Dan och Diane Riccio Fund for Neuroscience från UMASS Chan Medical School och Angel Fund, Inc.
Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
Antibodies for Western blot analysis | |||
anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
Borate buffer components | |||
Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
Cell culture materials | |||
6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
Cell dissociation reagents | |||
Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
Coating reagents for cell culture | |||
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
Components of iPSC media | |||
mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
Components of EB media | |||
BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
iPSC media | final concentration 1x | ||
ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
Components of PMP base media | |||
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
Components of PMP complete media | |||
55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
PMP base media | final concentration 1x | ||
Components of iMG base media | |||
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
Components of iMG complete media | |||
55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
iMG base media | final concentration 1x | ||
M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
Components of Induction base media | |||
DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
Components of Complete induction media | |||
Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
Induction base media | final concentration 1x | ||
ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
Components of Neuron media | |||
B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
iPSC lines used in this study | |||
KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
Synaptosome isolation reagents | |||
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
Phagocytosis assay dyes | |||
NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
Other cell-culture reagents | |||
Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
Software and Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |