Mänskliga mikroglialiknande celler: Differentiering från inducerade pluripotenta stamceller och de vitro-feocytanalys av levande celler med hjälp av humana synaptosomer

Microglia är de inneboende immuncellerna i centrala nervsystemet (CNS) och spelar en avgörande roll för att utveckla CNS. Microglia är också viktiga i den vuxna hjärnan för att upprätthålla homeostas och aktivt svara på trauma och sjukdomsprocesser. Kumulativa bevis visar att mikroglia är viktiga bidragsgivare till patogenesen av flera neuroutvecklings- och neurodegenerativa sjukdomar ^1,2. Även om nuvarande kunskap om mikroglialbiologi huvudsakligen har härletts från musmodeller, har nyligen genomförda studier belyst viktiga skillnader mellan murin och mänsklig mikroglia, vilket understryker behovet av att utveckla teknik för att studera genetik och biologiska funktioner hos mänsklig mikroglia ^3,4. Isolering av mikroglia från dissekerad primärvävnad kan allvarligt modifiera mikrogliaegenskaper⁵, vilket potentiellt förvirrar resultat som erhållits med sådana celler. Det övergripande målet med denna metod är att differentiera humana iPSC till iMGs och därigenom tillhandahålla ett cellodlingssystem för att studera human mikroglia under basala förhållanden. Dessutom ingår en fagocytosanalys med ett helt mänskligt modellsystem häri som ett sätt att studera funktionaliteten hos iMGs, både som ett kvalitetskontrollmått och för att bedöma iMG-dysfunktion i samband med sjukdom.

Flera protokoll för mikrogliadifferentiering från iPSC har nyligen dykt upp i litteraturen 6,7,8,9,10. Potentiella nackdelar med vissa protokoll inkluderar förlängda eller långa perioder av differentiering, tillägg av flera tillväxtfaktorer och / eller komplexa experimentella förfaranden ^6,9,10. Här demonstreras en “användarvänlig” differentieringsmetod som rekapitulerar aspekter av mikroglia-ontogeni genom differentiering av iPSC till prekursorceller som kallas primitiva makrofagprekursorer (PMP)^7,11. PMP: er genereras som beskrivits tidigare, med vissa optimeringar som presenteras häri¹². PMP: erna efterliknar MYB-oberoende äggula-sac-härledda makrofager, som ger upphov till mikroglia under embryonal utveckling genom att invadera hjärnan innan blod-hjärnbarriären stängs¹³. För att terminalt differentiera PMP till iMGs använde vi en snabb och förenklad monokulturmetod baserad på protokoll från Haenseler et al. och Brownjohn et al., med vissa modifieringar för att generera en effektiv mikrogliadifferentieringsmetod där iMGs robust uttrycker mikrogliaberikade markörer ^7,8. Denna differentieringsmetod kan reproduceras i laboratorier med expertis inom iPSC: s kultur och med forskningsmål som syftar till att studera mikrogliabiologi med hjälp av ett mänskligt modellsystem.

iPSC-härledd mikroglia representerar en biologiskt relevant källa till human mikroglia för in vitro-experiment och är ett viktigt verktyg för att undersöka mikrogliala kanoniska funktioner, inklusive fagocytos. Microglia är de professionella fagocyterna i hjärnan och CNS, där de rensar cellskräp, aggregerade proteiner och nedbrutet myelin¹⁴. Microglia fungerar också vid synaptisk ombyggnad genom att uppsluka synapser och i försvaret mot yttre infektioner genom fagocytos av patogener^15,16. I detta protokoll bedöms fagocytos av iMGs med användning av humana synaptosomer som material för iMG-uppslukande. För detta ändamål beskrivs en beskrivning för isolerande synaptosomer härledda från humana i³LMN. De i³LMN-härledda humana synaptosomerna är märkta med ett pH-känsligt färgämne som möjliggör kvantifiering av synaptosomer lokaliserade i sura fack under fagosombearbetning och nedbrytning in vitro. En fagocytosanalys med hjälp av levande cellmikroskopi visas för att övervaka den dynamiska processen för mikroglia-uppslukande i realtid. Denna funktionella analys skapar en grund för att undersöka eventuella defekter i mikroglial fagocytos i hälsa och sjukdom med hjälp av ett komplett mänskligt system.