Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

As microglias são as células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC) e desempenham um papel crucial no desenvolvimento do SNC. A micróglia também é importante no cérebro adulto para manter a homeostase e responder ativamente a processos de trauma e doença. Evidências cumulativas mostram que a micróglia é um dos principais contribuintes para a patogênese de múltiplas doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas ^1,2. Embora o conhecimento atual sobre a biologia microglial tenha sido predominantemente derivado de modelos de camundongos, estudos recentes têm elucidado diferenças importantes entre a micróglia murina e humana, ressaltando a necessidade de desenvolvimento de tecnologias para estudar a genética e as funções biológicas da micróglia humana ^3,4. O isolamento da micróglia do tecido primário dissecado pode modificar severamente as propriedades da micróglia⁵, potencialmente confundindo os resultados adquiridos com essas células. O objetivo geral deste método é diferenciar as iPSCs humanas em iMGs, fornecendo assim um sistema de cultura celular para estudar a micróglia humana sob condições basais. Além disso, um ensaio de fagocitose usando um sistema de modelo totalmente humano é incluído aqui como um meio de estudar a funcionalidade dos iMGs, tanto como uma medida de controle de qualidade quanto para avaliar a disfunção de iMG no contexto da doença.

Múltiplos protocolos para diferenciação da micróglia a partir de iPSCs têm surgido recentemente na literatura ^6,7,8,9,10. As desvantagens potenciais de alguns protocolos incluem períodos prolongados ou longos de diferenciação, a adição de múltiplos fatores de crescimento e/ou procedimentos experimentais complexos ^6,9,10. Aqui, demonstra-se um método de diferenciação “user-friendly” que recapitula aspectos da ontogenia da micróglia por meio da diferenciação de iPSCs em células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)^7,11. Os PMPs são gerados conforme descrito anteriormente, com algumas otimizações aqui apresentadas¹². Os PMPs imitam macrófagos derivados de saco vitelino independentes de MYB, que dão origem à micróglia durante o desenvolvimento embrionário, invadindo o cérebro antes do fechamento da barreira hematoencefálica¹³. Para diferenciar terminalmente PMPs em iMGs, utilizamos um método de monocultura rápido e simplificado baseado em protocolos de Haenseler et al. e Brownjohn et al., com algumas modificações para gerar um método eficiente de diferenciação de micróglias no qual os iMGs expressam robustamente marcadores enriquecidos com microglia ^7,8. Este método de diferenciação pode ser reproduzido em laboratórios com experiência na cultura de iPSCs e com objetivos de pesquisa com o objetivo de estudar a biologia da micróglia usando um sistema de modelo humano.

A micróglia derivada da iPSC representa uma fonte biologicamente relevante de micróglia humana para experimentação in vitro e é uma ferramenta importante para investigar as funções canônicas microgliais, incluindo a fagocitose. As micróglias são os fagócitos profissionais do cérebro e do SNC, onde limpam detritos celulares, proteínas agregadas e mielina degradada¹⁴. A micróglia também atua no remodelamento sináptico por engolfamento de sinapses e na defesa contra infecções externas por meio da fagocitose de patógenos^15,16. Neste protocolo, a fagocitose por iMGs é avaliada usando sinaptossomos humanos como material para engolfamento de iMG. Para este fim, uma descrição para isolar sinaptossomos derivados de i³LMNs humanos é descrita. Os sinaptossomos humanos derivados de LMN i³são marcados com um corante sensível ao pH que permite a quantificação de sinaptossomos localizados dentro de compartimentos ácidos durante o processamento e degradação de fagossomos in vitro. Um ensaio de fagocitose usando microscopia de células vivas é mostrado para monitorar o processo dinâmico de engolfamento da micróglia em tempo real. Este ensaio funcional estabelece uma base para investigar possíveis defeitos na fagocitose microglial na saúde e na doença usando um sistema humano completo.