الحقن المجهري للبطين الدماغي لعديد السكاريد الشحمي في يرقات الزرد لتقييم الالتهاب العصبي والسمية العصبية
Summary
يوضح هذا البروتوكول الحقن الدقيق لعديد السكاريد الشحمي في منطقة بطين الدماغ في نموذج يرقات الزرد لدراسة الاستجابة الالتهابية العصبية الناتجة والسمية العصبية.
Abstract
الالتهاب العصبي هو لاعب رئيسي في الاضطرابات العصبية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية. لذلك ، من الأهمية بمكان البحث وتطوير نماذج بديلة للالتهابات العصبية في الجسم الحي لفهم دور الالتهاب العصبي في التنكس العصبي. في هذه الدراسة ، تم تطوير نموذج يرقات الزرد للالتهاب العصبي بوساطة الحقن المجهري البطيني لعديد السكاريد الشحمي (LPS) للحث على الاستجابة المناعية والسمية العصبية والتحقق من صحته. تم استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا elavl3: mCherry و ETvmat2: GFP و mpo: EGFP للقياس الكمي في الوقت الفعلي لصلاحية الخلايا العصبية في الدماغ عن طريق التصوير المباشر الفلوري المدمج مع تحليل شدة التألق. تم تسجيل السلوك الحركي ليرقات الزرد تلقائيا باستخدام مسجل تتبع الفيديو. تم التحقيق في محتوى أكسيد النيتريك (NO) ، ومستويات تعبير mRNA للسيتوكينات الالتهابية بما في ذلك interleukin-6 (IL-6) ، interleukin-1β (IL-1β) ، وعامل نخر الورم البشري α (TNF-α) لتقييم الاستجابة المناعية التي يسببها LPS في رأس الزرد اليرقات. في 24 ساعة بعد حقن البطين الدماغي من LPS ، لوحظ فقدان الخلايا العصبية ونقص الحركة في يرقات الزرد. بالإضافة إلى ذلك ، زاد الالتهاب العصبي الناجم عن LPS من عدم إطلاق وتعبير mRNA ل IL-6 و IL-1β و TNF-α في رأس يرقات الزرد بعد 6 أيام من الإخصاب (dpf) ، وأدى إلى تجنيد العدلات في دماغ الزرد. في هذه الدراسة ، تم تحديد حقن الزرد مع LPS بتركيز 2.5-5 مجم / مل عند 5 dpf كحالة مثالية لمقايسة الالتهاب العصبي الدوائي. يقدم هذا البروتوكول منهجية جديدة وسريعة وفعالة للحقن المجهري للبطين الدماغي من LPS للحث على التهاب عصبي بوساطة LPS والسمية العصبية في يرقة الزرد ، وهو أمر مفيد لدراسة الالتهاب العصبي ويمكن استخدامه أيضا كفحص عالي الإنتاجية في الجسم الحي لفحص المخدرات.
Introduction
تم وصف الالتهاب العصبي بأنه عامل حاسم مضاد للأعصاب يشارك في التسبب في العديد من الأمراض التنكسية العصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)1. بعد الإهانات المرضية ، قد يؤدي الالتهاب العصبي إلى عواقب سلبية مختلفة ، بما في ذلك تثبيط تكوين الخلايا العصبية وتحريض موت الخلايا العصبية 2,3. في العملية الكامنة وراء الاستجابة لتحريض الالتهاب ، يتم إفراز العديد من السيتوكينات الالتهابية (مثل TNF-α و IL-1β و IL-6) في الفضاء خارج الخلية وتعمل كمكونات حاسمة في موت الخلايا العصبية وقمع تكوين الخلايا العصبية4،5،6.
الحقن الدقيق لوسطاء الالتهاب (مثل IL-1β و L-arginine والسموم الداخلية) في الدماغ يمكن أن يسبب تقليل الخلايا العصبية والتهاب الأعصاب7،8،9. عديد السكاريد الشحمي (LPS ، الشكل 1) ، وهو سم داخلي ممرض موجود في جدار الخلية للبكتيريا سالبة الجرام ، يمكن أن يحفز الالتهاب العصبي ، ويؤدي إلى تفاقم التنكس العصبي ، ويقلل من تكوين الخلايا العصبية في الحيوانات10. أدى حقن LPS مباشرة في الجهاز العصبي المركزي لدماغ الفأر إلى زيادة مستويات أكسيد النيتريك والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات ومنظمات أخرى11. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي الحقن التجسيمي ل LPS في بيئة الدماغ المحلية إلى الإفراط في إنتاج الجزيئات السمية العصبية ، مما يؤدي إلى ضعف الوظيفة العصبية والتطور اللاحق للأمراض التنكسية العصبية10،12،13،14،15. في مجال علم الأعصاب ، تعد الملاحظات المجهرية الحية والزمنية للعمليات الخلوية والبيولوجية في الكائنات الحية ضرورية لفهم الآليات الكامنة وراء التسبب في المرض والعمل الدوائي16. ومع ذلك ، فإن التصوير المباشر لنماذج الفئران من الالتهابات العصبية والسمية العصبية مقيد بشكل أساسي بعمق الاختراق البصري المحدود للفحص المجهري ، والذي يمنع التصوير الوظيفي والمراقبة الحية للعمليات التنموية17،18،19. لذلك ، فإن تطوير نماذج بديلة للالتهابات العصبية له أهمية كبيرة لتسهيل دراسة التطور المرضي ، والآلية الكامنة وراء الالتهاب العصبي والتنكس العصبي ، عن طريق التصوير الحي.
برز الزرد (Danio rerio) كنموذج واعد لدراسة الالتهاب العصبي والتنكس العصبي بسبب نظام المناعة الفطري المحفوظ تطوريا ، والشفافية البصرية ، وحجم القابض الجنيني الكبير ، وقابلية السحب الجيني ، ومدى ملاءمته للتصوير في الجسم الحي 19،20،21،22،23 . قامت البروتوكولات السابقة إما بحقن LPS مباشرة في صفار وبطين الدماغ الخلفي لأسماك الزرد اليرقية دون تقييم ميكانيكي ، أو ببساطة إضافة LPS إلى مياه الأسماك (وسط الاستزراع) للحث على استجابة مناعية جهازية قاتلة24،25،26،27. هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول للحقن الدقيق ل LPS في البطينين الدماغيين ، لتحفيز استجابة مناعية فطرية أو سمية عصبية في يرقات الزرد بعد 5 أيام من الإخصاب (dpf). تتجلى هذه الاستجابة من خلال فقدان الخلايا العصبية ، وعجز السلوك الحركي ، وزيادة إطلاق أكسيد النتريت ، وتفعيل التعبير الجيني الالتهابي ، وتجنيد العدلات في دماغ الزرد في 24 ساعة بعد الحقن.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشير كمية متزايدة من البيانات الوبائية والتجريبية إلى تورط الالتهابات البكتيرية والفيروسية المزمنة كعوامل خطر محتملة للأمراض التنكسية العصبية36. تؤدي العدوى إلى تنشيط العمليات الالتهابية والاستجابات المناعية للمضيف37. حتى لو كانت الاستجابة بمثابة آلية دفاعية ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعمت هذه الدراسة بمنح مقدمة من صندوق تنمية العلم والتكنولوجيا (FDCT) التابع لمنطقة ماكاو الإدارية الخاصة (المرجع رقم. FDCT0058/2019/A1 and 0016/2019/AKP)، ولجنة البحوث، جامعة ماكاو (MYRG2020-00183-ICMS and CPG2022-00023-ICMS)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81803398).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
Referências
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson’s disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer’s disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9′-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d’Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer’s disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
