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Neurociência

신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 유충 제브라피쉬에 지질 다당류의 뇌실 미세 주입

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64313
,
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade

Summary

이 프로토콜은 결과적인 신경 염증 반응과 신경 독성을 연구하기 위해 제브라 피쉬 애벌레 모델에서 뇌실 영역에 지질 다당류를 미세 주입하는 것을 보여줍니다.

Abstract

신경 염증은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 신경 장애의 핵심 요소입니다. 따라서 신경 퇴행에서 신경 염증의 역할을 이해하기 위해 대체 생체 내 신경 염증 모델을 연구하고 개발하는 것이 큰 관심입니다. 이 연구에서는 면역 반응과 신경 독성을 유도하기 위해 지질 다당류 (LPS)의 심실 미세 주입에 의해 매개되는 신경 염증의 유충 제브라 피쉬 모델이 개발되고 검증되었습니다. 트랜스제닉 제브라피쉬 라인 elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP 및 mpo:EGFP는 형광 강도 분석과 통합된 형광 라이브 이미징에 의한 뇌 뉴런 생존력의 실시간 정량화에 사용되었습니다. 제브라 피쉬 유충의 운동 행동은 비디오 추적 레코더를 사용하여 자동으로 기록되었습니다. 유충 제브라피쉬 머리에서 LPS 유도 면역 반응을 평가하기 위해 산화질소(NO)의 함량 및 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 인간 종양 괴사 인자 α(TNF-α)를 포함한 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 조사했습니다. LPS의 뇌실 주사 후 24 시간에 제브라 피쉬 유충에서 뉴런 손실과 운동 결핍이 관찰되었습니다. 또한, LPS 유도 신경염증은 수정 후 6일(dpf) 제브라피쉬 유충의 머리에서 NO 방출 및 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현을 증가시키고, 제브라피쉬 뇌에서 호중구의 동원을 초래하였다. 이 연구에서는 5dpf에서 2.5-5mg/mL의 농도로 LPS를 제브라피쉬에 주사하는 것이 이 약리학적 신경염증 분석의 최적 조건으로 결정되었습니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 유충에서 LPS 매개 신경염증 및 신경독성을 유도하기 위해 LPS의 뇌실 미세 주입을 위한 새롭고 빠르고 효율적인 방법론을 제시하며, 이는 신경염증 연구에 유용하며 고처리량 생체 내 약물 스크리닝 분석으로도 사용될 수 있습니다.

Introduction

신경 염증은 중추 신경계 (CNS)의 여러 신경 퇴행성 질환의 발병 기전에 관여하는 중요한 항 신경 인성 인자로 설명되었습니다 1. 병리학 적 모욕 후, 신경 염증은 신경 발생의 억제 및 신경 세포 사멸의 유도를 포함하여 다양한 부작용을 초래할 수 있습니다 2,3. 염증 유도에 대한 반응의 기초가되는 과정에서 여러 염증성 사이토 카인 (예 : TNF-α, IL-1β 및 IL-6)이 세포 외 공간으로 분비되어 뉴런 사멸 및 신경 발생억제에 중요한 구성 요소로 작용합니다 4,5,6.

염증 매개체 (예 : IL-1β, L- 아르기닌 및 내 독소)를 뇌에 미세 주입하면 신경 세포 감소 및 신경 염증 7,8,9가 발생할 수 있습니다. 그람 음성 박테리아의 세포벽에 존재하는 병원성 내독소인 리포폴리사카라이드(LPS, 그림 1)는 신경 염증을 유도하고 신경 퇴행을 악화시키며 동물의 신경 발생을 감소시킬 수 있습니다10. 마우스 뇌의 CNS에 직접 LPS 주사는 산화 질소, 전염증성 사이토카인 및 기타 조절자의 수준을 증가시켰다11. 더욱이, 국소 뇌 환경으로의 LPS의 정위 주사는 신경 독성 분자의 과도한 생산을 유도하여 신경 기능 장애 및 신경 퇴행성 질환10,12,13,14,15의 후속 발달을 초래할 수있다. 신경 과학 분야에서 살아있는 유기체의 세포 및 생물학적 과정에 대한 실시간 및 시간 경과 현미경 관찰은 병인 및 약리학 적 작용의 기본 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다16. 그러나, 신경 염증 및 신경 독성의 마우스 모델의 라이브 이미징은 근본적으로 현미경의 제한된 광학 침투 깊이에 의해 제한되며, 이는 기능적 이미징 및 발달 과정17,18,19의 라이브 관찰을 배제합니다. 따라서 대체 신경 염증 모델의 개발은 라이브 이미징에 의한 병리학 적 발달 및 신경 염증 및 신경 퇴행의 기본 메커니즘에 대한 연구를 용이하게하는 데 큰 관심거리입니다.

Zebrafish (Danio rerio)는 진화 적으로 보존 된 선천적 면역 체계, 광학 투명성, 큰 배아 클러치 크기, 유전 적 다루기 성 및 생체 내 이미징에 대한 적합성으로 인해 신경 염증 및 신경 퇴행을 연구하는 유망한 모델로 부상했습니다. 19,20,21,22,23 . 이전 프로토콜은 기계 론적 평가없이 유충 제브라 피쉬의 난황과 뒷뇌 뇌실에 LPS를 직접 주입하거나 단순히 LPS를 어류 물 (배양 배지)에 추가하여 치명적인 전신 면역 반응을 유도했습니다 24,25,26,27. 여기에서 우리는 수정 후 5일(dpf) 제브라피쉬 유충에서 선천성 면역 반응 또는 신경독성을 유발하기 위해 뇌실에 LPS를 미세 주입하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 반응은 신경 세포 손실, 운동 행동 결핍, 아질산염 산화물 방출 증가, 염증 유전자 발현의 활성화 및 주사 후 24 시간에 제브라 피쉬 뇌의 호중구 모집에 의해 입증됩니다.

Protocol

AB 야생형 제브라피쉬 및 형질전환 제브라피쉬 라인 elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, 및 mpo:EGFP는 중국의학연구소(ICMS)로부터 입수하였다. 동물 실험에 대한 윤리적 승인 (UMARE-030-2017)은 마카오 대학의 동물 연구 윤리위원회에서 부여되었으며 프로토콜은 기관 동물 관리 지침을 따릅니다. 1. 제브라 피쉬 배아와 애벌레 축산 이전에 보고된 대로 자연 쌍 교배에 의해 제?…

Representative Results

여기에 설명 된 워크 플로는 제브라 피쉬 유충에서 LPS 매개 신경 염증 및 신경 독성을 유도하기위한 새롭고 빠르고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 설명된 프로토콜에서 5개의 dpf 제브라피쉬에 LPS(그림 1)를 미세 주입기를 사용하여 뇌실에 주입했습니다(그림 2A-C). 뇌실 부위로의 성공적인 주사는 1% Evans blue 염색을 사용하여…

Discussion

역학 및 실험 데이터의 증가는 만성 세균 및 바이러스 감염을 신경 퇴행성 질환의 가능한 위험 인자로 암시합니다36. 감염은 염증 과정의 활성화와 숙주 면역 반응을 유발합니다37. 반응이 방어 메카니즘으로서 작용하더라도, 과활성화된 염증은 신경 발생에 해롭고, 염증 환경은 신생아 뉴런(38)의 생존을 허용하지 않는다. 결과적으로, 숙주 뉴?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 마카오 SAR의 과학 기술 개발 기금 (FDCT)의 보조금으로 지원되었습니다 (참조 번호. FDCT0058/2019/A1 및 0016/2019/AKP), 마카오 대학교 연구 위원회(MYRG2020-00183-ICMS 및 CPG2022-00023-ICMS) 및 중국 국립 자연 과학 재단(No. 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology
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Referências

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He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).
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