न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए लार्वा ज़ेबराफिश में लिपोपॉलेसेकेराइड के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन
Summary
यह प्रोटोकॉल परिणामी न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया और न्यूरोटॉक्सिसिटी का अध्ययन करने के लिए एक जेब्राफिश लार्वा मॉडल में मस्तिष्क वेंट्रिकुलर क्षेत्र में लिपोपॉलेसेकेराइड के माइक्रोइंजेक्शन को प्रदर्शित करता है।
Abstract
न्यूरोइन्फ्लेमेशन न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों सहित विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है। इसलिए, न्यूरोडीजेनेरेशन में न्यूरोइन्फ्लेमेशन की भूमिका को समझने के लिए विवो न्यूरोइन्फ्लेमेशन मॉडल में अनुसंधान और विकल्प विकसित करना बहुत रुचि रखता है। इस अध्ययन में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और न्यूरोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करने के लिए लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) के वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन द्वारा मध्यस्थता वाले न्यूरोइन्फ्लेमेशन के एक लार्वा जेब्राफिश मॉडल को विकसित और मान्य किया गया था। ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश लाइनों elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP, और mpo: EGFP का उपयोग प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण के साथ एकीकृत प्रतिदीप्ति लाइव इमेजिंग द्वारा मस्तिष्क न्यूरॉन व्यवहार्यता के वास्तविक समय की मात्रा का ठहराव करने के लिए किया गया था। जेब्राफिश लार्वा के लोकोमोटर व्यवहार को वीडियो-ट्रैकिंग रिकॉर्डर का उपयोग करके स्वचालित रूप से रिकॉर्ड किया गया था। नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) की सामग्री, और इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) सहित भड़काऊ साइटोकिन्स के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर, और मानव ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α (टीएनएफ -α) की जांच लार्वा जेब्राफिश सिर में एलपीएस-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए की गई थी। एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन के 24 घंटे बाद, जेब्राफिश लार्वा में न्यूरॉन्स का नुकसान और हरकत की कमी देखी गई। इसके अलावा, एलपीएस-प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन ने निषेचन (डीपीएफ) जेब्राफिश लार्वा के 6 दिनों के बाद के सिर में आईएल -6, आईएल -1, और टीएनएफ -α की कोई रिहाई और एमआरएनए अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं की, और इसके परिणामस्वरूप जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती हुई। इस अध्ययन में, 5 डीपीएफ पर 2.5-5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर एलपीएस के साथ ज़ेब्राफिश का इंजेक्शन इस फार्माकोलॉजिकल न्यूरोइन्फ्लेमेशन परख के लिए इष्टतम स्थिति के रूप में निर्धारित किया गया था। यह प्रोटोकॉल एक ज़ेब्राफिश लार्वा में एलपीएस-मध्यस्थता न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करने के लिए एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकल माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक नई, त्वरित और कुशल पद्धति प्रस्तुत करता है, जो न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है और विवो ड्रग स्क्रीनिंग परख में उच्च-थ्रूपुट के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
न्यूरोइन्फ्लेमेशन को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1 के कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के रोगजनन में शामिल एक महत्वपूर्ण एंटी-न्यूरोजेनिक कारक के रूप में वर्णित किया गया है। पैथोलॉजिकल अपमान के बाद, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रतिकूल परिणाम हो सकते हैं, जिसमें न्यूरोजेनेसिस का निषेध और न्यूरोनल सेल मृत्यु 2,3 का प्रेरण शामिल है। सूजन प्रेरण की प्रतिक्रिया को अंतर्निहित प्रक्रिया में, कई भड़काऊ साइटोकिन्स (जैसे टीएनएफ-α, आईएल -1, और आईएल -6) बाह्य अंतरिक्ष में स्रावित होते हैं और न्यूरॉन मृत्यु और न्यूरोजेनेसिस 4,5,6 के दमन में महत्वपूर्णघटकों के रूप में कार्य करते हैं।
मस्तिष्क में सूजन मध्यस्थों (जैसे आईएल -1, एल-आर्जिनिन और एंडोटॉक्सिन) का माइक्रोइंजेक्शन न्यूरोनल सेल में कमी और न्यूरोइन्फ्लेमेशन 7,8,9 का कारण बन सकता है। लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस, चित्रा 1), ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की कोशिका भित्ति में मौजूद एक रोगजनक एंडोटॉक्सिन, न्यूरोइन्फ्लेमेशन को प्रेरित कर सकता है, न्यूरोडीजेनेरेशन को बढ़ा सकता है, और जानवरों में न्यूरोजेनेसिस को कम करसकता है। माउस मस्तिष्क के सीएनएस में सीधे एलपीएस इंजेक्शन ने नाइट्रिक ऑक्साइड, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स और अन्य नियामकोंके स्तर में वृद्धि की। इसके अलावा, स्थानीय मस्तिष्क के वातावरण में एलपीएस का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन न्यूरोटॉक्सिक अणुओं के अत्यधिक उत्पादन को प्रेरित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ न्यूरोनल फ़ंक्शन और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का बाद में विकास 10,12,13,14,15 हो सकता है। तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र में, जीवित जीवों में सेलुलर और जैविक प्रक्रियाओं के लाइव और टाइम-कोर्स सूक्ष्म अवलोकन रोगजनन और औषधीय कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्रको समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी के माउस मॉडल की लाइव इमेजिंग मूल रूप से माइक्रोस्कोपी की सीमित ऑप्टिकल प्रवेश गहराई से बाधित है, जो कार्यात्मक इमेजिंग और विकास प्रक्रियाओं के लाइव अवलोकन को रोकती है 17,18,19। इसलिए, लाइव इमेजिंग द्वारा पैथोलॉजिकल विकास, और न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन के अंतर्निहित तंत्र के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए वैकल्पिक न्यूरोइन्फ्लेमेशन मॉडल का विकास बहुत रुचि रखता है।
ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) अपने विकासात्मक रूप से संरक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली, ऑप्टिकल पारदर्शिता, बड़े भ्रूण क्लच आकार, आनुवंशिक पथीयता और विवो इमेजिंग 19,20,21,22,23 के लिए उपयुक्तता के कारण न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक मॉडल के रूप में उभरा है। . पिछले प्रोटोकॉल ने या तो यांत्रिक मूल्यांकन के बिना लार्वा ज़ेब्राफिश की जर्दी और हिंदब्रेन वेंट्रिकल में सीधे एलपीएस इंजेक्ट किया है, या घातक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 24,25,26,27 को प्रेरित करने के लिए मछली के पानी (कल्चर माध्यम) में एलपीएस जोड़ा है। यहां, हमने मस्तिष्क वेंट्रिकल्स में एलपीएस के माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया, ताकि निषेचन (डीपीएफ) ज़ेब्राफिश लार्वा के बाद 5 दिनों में एक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या न्यूरोटॉक्सिसिटी को ट्रिगर किया जा सके। यह प्रतिक्रिया न्यूरोनल सेल हानि, लोकोमोटर व्यवहार घाटे, नाइट्राइट ऑक्साइड रिलीज में वृद्धि, भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति की सक्रियता और इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती से स्पष्ट है।
Protocol
Representative Results
Discussion
महामारी विज्ञान और प्रयोगात्मक डेटा की बढ़ती मात्रा न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए संभावित जोखिम कारकों के रूप में पुरानी जीवाणु और वायरल संक्रमणको फंसाती है। संक्रमण भड़काऊ प्रक्रियाओं …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को मकाओ एसएआर के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास कोष (एफडीसीटी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एफडीसीटी0058/2019/ए1 और 0016/2019/एकेपी, अनुसंधान समिति, मकाऊ विश्वविद्यालय (MYRG2020-00183-ICMS और CPG2022-00023-ICMS), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 81803398)।
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
Referências
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson’s disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer’s disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9′-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d’Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer’s disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
