Denne protokollen presenterer syntesen av sykliske peptider via bisalkylering mellom cystein og metionin og den lettvinte tiol-yne-reaksjonen utløst av propargylsulfoniumsenteret.
I de senere år har sykliske peptider tiltrukket seg økende oppmerksomhet innen narkotikaforskning på grunn av deres gode biologiske aktiviteter, og som en konsekvens blir de nå brukt klinisk. Det er derfor viktig å søke effektive strategier for å syntetisere sykliske peptider for å fremme deres anvendelse innen narkotikaforskning. Dette papiret rapporterer en detaljert protokoll for effektiv syntese av sykliske peptider ved bruk av on-harpiks eller intramolekylær (intermolekylær) bisalkylering. Ved hjelp av denne protokollen ble lineære peptider syntetisert ved å dra nytte av fastfase peptidsyntese med cystein (Cys) og metionin (Met) koblet samtidig på harpiksen. Videre ble sykliske peptider syntetisert via bisalkylering mellom Met og Cys ved hjelp av en tunable tether og et on-tether sulfoniumsenter. Hele den syntetiske ruten kan deles inn i tre hovedprosesser: debeskyttelse av Cys på harpiksen, koblingen av linkeren og sykliseringen mellom Cys og Met i en trifluoreddiksyre (TFA) spaltningsløsning. Videre, inspirert av reaktiviteten til sulfoniumsenteret, ble en propargylgruppe festet til Met for å utløse tiol-yne-tilsetning og danne et syklisk peptid. Deretter ble råpeptidene tørket og oppløst i acetonitril, separert og deretter renset ved høyytelses væskekromatografi (HPLC). Molekylvekten til det sykliske peptidet ble bekreftet ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), og stabiliteten til den sykliske peptidkombinasjonen med reduktanten ble videre bekreftet ved bruk av HPLC. I tillegg ble det kjemiske skiftet i det sykliske peptidet analysert ved 1H kjernemagnetisk resonans (1H NMR) spektra. Samlet sett hadde denne protokollen som mål å etablere en effektiv strategi for syntetisering av sykliske peptider.
Protein-protein-interaksjoner (PPI)1 spiller en sentral rolle i forskning og utvikling av legemidler. Å konstruere stabiliserte peptider med fast konformasjon ved kjemiske midler er en av de viktigste metodene for å utvikle mimetiske motiver av PPI2. Til dags dato har flere sykliske peptider som retter seg mot PPI blitt utviklet for klinisk bruk3. De fleste peptider er begrenset til en α-helix-konformasjon for å redusere konformasjonsentropien og forbedre metabolsk stabilitet, målbindende affinitet og cellepermeabilitet 4,5. I løpet av de siste 2 tiårene har sidekjedene til Cys6,7, lysin8,9, tryptofan 10, arginin11 og Met 12,13 blitt satt inn i unaturlige aminosyrer for å fikse peptidet i en syklisk konformasjon. Slike sykliske peptider kan målrette mot et unikt kjemisk rom eller spesielle steder, og derved utløse en kovalent reaksjon for å danne protein-peptid kovalent binding14,15,16,17. I en nylig rapport fra Yu et al., ble et kloracetamid forankret på domenet til peptidligander, noe som sikrer en kovalent konjugeringsreaksjon med utmerket proteinspesifisitet18. Videre ble elektrofile stridshoder, som akrylamid og arylsulfonylfluorid (ArSO2F), videre innlemmet i peptider av Walensky et al.19 for å danne stabiliserte peptidkovalente hemmere og forbedre antitumoreffekten av peptidhemmere. Derfor er det svært viktig å introdusere en ekstra funksjonell gruppe for å kovalent modifisere protein-peptidligander20. Disse gruppene reagerer ikke bare med proteiner på sidekjeden, men stabiliserer også den sekundære strukturen til peptidet21. Imidlertid er anvendelsen av kovalent modifiserte proteiner indusert av peptidligander begrenset på grunn av den kompliserte syntetiske ruten og den ikke-spesifikke bindingen av de kjemiske gruppene22,23. Effektive strategier for syntese av sykliske peptider er derfor presserende nødvendig.
Inspirert av de mangfoldige strategiene til sykliske peptider 2,24,25,26, forsøker denne protokollen å utvikle en enkel og effektiv metode for stabilisering av peptider. I tillegg bemerket vi at sidekjedegruppen til et stabilt peptid kunne reagere kovalent med et målprotein når det var romlig nær peptidligandene. Mangelen på kjemisk modifisert Met ble fylt av Deming-gruppen i 2013 ved å utvikle en ny metode for å produsere selektivt modifisert peptidmetionin27. Basert på denne bakgrunnen fokuserte Shi og medarbeidere på utviklingen av ringlukkingen av sidekjeder for å danne et sulfoniumsaltsenter. Når peptidliganden kombineres med målproteinet, reagerer sulfoniumsaltgruppen kovalent med det romlig nære Cys-proteinet. Shi og medarbeidere har de siste årene utviklet en ny metode for stabilisering av syklisk peptid28. Sulfoniumsaltet på det sykliske peptidet ble redusert med et reduksjonsmiddel med en sulfhydrylgruppe som reversibelt ble redusert til Met. Reaksjonen hadde imidlertid lav effektivitet, noe som var skadelig for påfølgende biologiske applikasjonsstudier. I den nåværende studien ble en Met-Cys og propargylbromid-Cys ringlukkingsreaksjon designet, med et enkelt sulfoniumsalt igjen på sidekjeden til det sykliske peptidet. Sulfoniumsaltet fungerte som et nytt stridshode som reagerte kovalent med proteinet Cys under romlig nærhet. Kort fortalt ble et Cys og Met-mutert peptid syklisert ved intramolekylær alkylering, noe som resulterte i generering av et on-tether sulfoniumsenter. I denne prosessen var dannelsen av en sidekjedebro kritisk for sykliske peptider. Samlet sett beskriver denne protokollen en detaljert sulfoniumbasert peptidsyklisering som oppnås ved bruk av enkle reaksjonsforhold og operasjoner. Målet er å utvikle en mulig metode for videre brede biologiske anvendelser.
Den syntetiske tilnærmingen beskrevet i dette papiret gir en metode for å syntetisere sykliske peptider ved hjelp av Cys og Met i peptidsekvensen, der de grunnleggende lineære peptidene er konstruert av vanlige fastfase peptidsynteseteknikker. For bisalkylering av sykliske peptider mellom Cys og Met, kan hele syntetiske ruten deles inn i tre hovedprosesser: debeskyttelse av Cys på harpiksen, koblingen av linkeren og sykliseringen mellom Cys og Met i en trifluoreddiksyrespaltningsløsning. Spesielt ble fjerningen av d…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner økonomisk støtte fra National Key R&D Program of China (2021YFC2103900); Natural Science Foundation of China tilskudd (21778009, og 21977010); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (2022A1515010996 og 2020A1515010521): Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 og JCYJ20200109140406047); og Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions grant (2019SHIBS0004). Forfatterne anerkjenner tidsskriftstøtte fra Chemical Science , The Royal Society of Chemistry for referanse 30 og The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, for referanse 31.
1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
Formic acid | Energy | W810042 | |
High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
Methanol | Aldrich | 9758 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Triethylamine | Energy | B010737 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |