이 프로토콜은 시스테인과 메티오닌 사이의 비스알킬화와 프로파길 설포늄 중심에 의해 유발되는 용이한 티올-인 반응을 통한 고리형 펩타이드의 합성을 제시합니다.
최근 몇 년 동안 고리형 펩타이드는 우수한 생물학적 활성으로 인해 약물 발견 분야에서 점점 더 많은 관심을 끌고 있으며 그 결과 현재 임상적으로 사용되고 있습니다. 따라서 약물 발견 분야에서의 적용을 촉진하기 위해 순환 펩타이드를 합성하기 위한 효과적인 전략을 찾는 것이 중요합니다. 이 논문은 온레진 또는 분자내(분자간) 비스알킬화를 사용하여 고리형 펩타이드의 효율적인 합성을 위한 자세한 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 선형 펩티드는 수지에 동시에 결합 된 시스테인 (Cys) 및 메티오닌 (Met)과의 고체상 펩티드 합성을 이용하여 합성되었다. 또한, 환형 펩티드는 조정 가능한 테더 및 온테더 설포늄 센터를 사용하여 Met와 Cys 사이의 비스알킬화를 통해 합성되었습니다. 전체 합성 경로는 세 가지 주요 공정으로 나눌 수 있습니다 : 수지에 대한 Cys의 탈보호, 링커의 커플 링, 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 절단 용액에서 Cys와 Met 간의 고리 화. 또한, 설포늄 중심의 반응성에서 영감을 받아 프로파길 그룹을 Met에 부착하여 티올-인 첨가를 유발하고 고리형 펩타이드를 형성했습니다. 그 후, 조 펩티드를 건조 및 아세토니트릴에 용해시키고, 분리한 다음, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 고리형 펩타이드의 분자량은 액체크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)으로 확인하였고, 고리형 펩타이드와 환원제의 결합의 안정성은 HPLC를 이용하여 추가로 확인하였다. 또한, 고리형 펩타이드의 화학적 이동을 1H 핵자기 공명(1HNMR) 스펙트럼으로 분석하였다. 전반적으로, 이 프로토콜은 고리형 펩타이드를 합성하기 위한 효과적인 전략을 수립하는 것을 목표로 했습니다.
단백질-단백질 상호작용(PPI)1은 약물 연구 및 개발에서 중추적인 역할을 합니다. 화학적 수단에 의해 고정된 형태를 갖는 안정화된 펩티드를 구축하는 것은 PPIs2의 모방 모티프를 개발하기 위한 가장 중요한 방법 중 하나이다. 현재까지 PPI를 표적으로 하는 여러 고리형 펩타이드가 임상용으로 개발되었습니다3. 대부분의 펩타이드는 구조적 엔트로피를 감소시키고 대사 안정성, 표적 결합 친화도 및 세포 투과성 4,5를 개선하기 위해 α 나선 형태로 제한됩니다. 지난 2 년 동안 Cys 6,7, 라이신8,9, 트립토판 10, 아르기닌 11 및 Met12,13의 측쇄가 비천연 아미노산에 삽입되어 펩타이드를 순환 형태로 고정했습니다. 이러한 고리형 펩티드는 독특한 화학적 공간 또는 특수 부위를 표적화할 수 있고, 이에 따라 공유 반응을 촉발하여 단백질-펩티드 공유 결합14,15,16,17을 형성할 수 있다. Yu et al.의 최근 보고서에서, 클로로아세트아미드는 펩티드 리간드의 도메인에 고정되어 우수한 단백질 특이성을 갖는 공유 접합 반응을 보장하였다18. 더욱이, 아크릴아미드 및 아릴 설포닐 플루오라이드 (ArSO2F)와 같은 친전자성 탄두를 Walensky et al.19에 의해 펩티드에 추가로 통합하여 안정화된 펩티드 공유 억제제를 형성하고 펩티드 억제제의 항종양 효과를 개선하였다. 따라서, 단백질-펩타이드 리간드(20)를 공유적으로 변형시키기 위해 추가적인 작용기를 도입하는 것이 매우 중요하다. 이들 그룹은 측쇄 상의 단백질과 반응할 뿐만 아니라 펩티드(21)의 2차 구조를 안정화시킨다. 그러나, 펩티드 리간드에 의해 유도 된 공유 변형 단백질의 적용은 복잡한 합성 경로 및 화학 그룹22,23의 비특이적 결합으로 인해 제한된다. 따라서, 순환 펩티드의 합성을 위한 효과적인 전략이 시급히 요구된다.
순환 펩타이드 2,24,25,26의 다양한 전략에서 영감을 받은 이 프로토콜은 펩타이드를 안정화하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 개발하려고 시도합니다. 또한, 안정한 펩타이드의 측쇄기가 펩타이드 리간드에 공간적으로 가까울 때 표적 단백질과 공유 결합 반응 할 수 있음을 주목했다. 화학적으로 변형 된 Met의 부족은 선택적으로 변형 된 펩티드 메티오닌27을 생산하기위한 새로운 방법을 개발함으로써 2013 년 Deming 그룹에 의해 채워졌습니다. 이러한 배경을 바탕으로 Shi 등은 술포늄 염 중심을 형성하기 위해 측쇄의 고리 폐쇄 개발에 중점을 두었습니다. 펩타이드 리간드가 표적 단백질과 결합하면 술포늄 염 그룹은 공간적으로 가까운 Cys 단백질과 공유 적으로 반응합니다. 최근에, Shi 등은 고리형 펩티드28을 안정화시키기 위한 새로운 방법을 설계하였다. 고리형 펩티드 상의 술포늄염은 Met로 가역적으로 환원된 술프하이드릴 기를 갖는 환원제에 의해 환원되었다. 그러나, 반응은 효율이 낮았으며, 이는 후속 생물학적 응용 연구에 해롭다. 현재 연구에서, Met-Cys 및 프로파길 브로마이드-Cys 고리-폐쇄 반응이 설계되었으며, 고리형 펩티드의 측쇄에 단일 설포늄 염이 남아 있습니다. 술포늄염은 공간적 근접성 하에서 단백질 Cys와 공유 적으로 반응하는 새로운 탄두로 작용했습니다. 간략하게, Cys 및 Met 돌연변이 펩티드는 분자내 알킬화에 의해 고리화되어, 온-테더 설포늄 중심의 생성을 초래하였다. 이 과정에서 측쇄 브리지의 형성은 고리형 펩타이드에 매우 중요했습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 간단한 반응 조건 및 조작을 사용하여 달성되는 상세한 술포늄 기반 펩타이드 고리화를 설명합니다. 목표는 더 광범위한 생물학적 응용을위한 잠재적 인 방법을 개발하는 것입니다.
이 논문에 기술된 합성 접근법은 펩티드 서열에서 Cys 및 Met를 사용하여 고리형 펩티드를 합성하는 방법을 제공하며, 여기서 기본 선형 펩티드는 일반적인 고체상 펩티드 합성 기술에 의해 구축된다. Cys와 Met 사이의 사이클릭 펩타이드의 비스알킬화를 위해, 전체 합성 경로는 세 가지 주요 공정으로 나눌 수 있다: 수지 상의 Cys의 탈보호, 링커의 커플링, 및 트리플루오로아세트산 절단 용액에서의 C…
The authors have nothing to disclose.
우리는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFC2103900)의 재정 지원을 인정합니다. 중국 자연 과학 재단 보조금 (21778009 및 21977010); 광동성 자연 과학 재단(2022A1515010996 및 2020A1515010521): 선전 과학 기술 혁신 위원회, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 및 JCYJ20200109140406047); 및 심천-홍콩 뇌 과학 연구소-심천 기초 연구 기관 보조금(2019SHIBS0004). 저자는 화학 과학, 왕립 화학 학회 (Royal Society of Chemistry)의 참고 문헌 30 및 유기 화학 저널 (The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society)의 참고 문헌 31을 인정합니다.
1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
Formic acid | Energy | W810042 | |
High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
Methanol | Aldrich | 9758 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Triethylamine | Energy | B010737 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |