该协议介绍了通过半胱氨酸和蛋氨酸之间的双烷基化以及由炔丙基锍中心触发的简单硫醇 – 炔反应 合成 环肽。
近年来,环肽因其优异的生物活性而在药物发现领域受到越来越多的关注,因此,它们现在被临床使用。因此,寻求合成环肽的有效策略以促进其在药物发现领域的应用至关重要。本文报告了使用树脂上或分子内(分子间)联烷基化高效合成环肽的详细方案。使用该协议,利用固相肽合成,半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)同时偶联在树脂上,从而合成线性肽。此外,使用可调系绳和系绳上的锍中心通过Met和Cys之间的联烷基化合成环肽。整个合成路线可分为三个主要过程:Cys在树脂上的脱保护,接头的偶联以及Cys与Met在三氟乙酸(TFA)裂解溶液中的环化。此外,受锍中心反应性的启发,炔丙基连接到Met上以触发硫醇-炔基加成并形成环肽。之后,将粗肽干燥并溶解在乙腈中,分离,然后通过高效液相色谱(HPLC)纯化。采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)确认了环肽的分子量,并利用HPLC进一步确认了环肽与还原剂组合的稳定性。此外,通过1 H核磁共振(1H NMR)波谱分析了环肽中的化学位移。总体而言,该协议旨在建立合成环肽的有效策略。
蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)1在药物研发中起着关键作用。通过化学方法构建具有固定构象的稳定肽是开发PPIs模拟基序的最重要方法之一2。迄今为止,已经开发了几种靶向PPI的环肽用于临床3。大多数肽被限制在α螺旋构象中,以降低构象熵并改善代谢稳定性、靶标结合亲和力和细胞通透性4,5。在过去的20年中,Cys6,7,赖氨酸8,9,色氨酸10,精氨酸11和Met 12,13的侧链已入到非天然氨基酸中,以将肽固定成环状构象。这种环肽可以靶向独特的化学空间或特殊位点,从而触发共价反应以形成蛋白质-肽共价结合14,15,16,17。在Yu等人最近的一份报告中,氯乙酰胺被锚定在肽配体结构域上,确保具有出色蛋白质特异性的共价偶联反应18。此外,Walensky等人将丙烯酰胺和芳基磺酰氟(ArSO2F)等亲电弹头进一步掺入肽中19,形成稳定的肽共价抑制剂,提高肽抑制剂的抗肿瘤作用。因此,引入额外的官能团以共价修饰蛋白质-肽配体20是非常重要的。这些基团不仅与侧链上的蛋白质反应,而且还稳定肽21的二级结构。然而,由于复杂的合成路线和化学基团22,23的非特异性结合,由肽配体诱导的共价修饰蛋白的应用受到限制。因此,迫切需要合成环肽的有效策略。
受环肽2,24,25,26的多种策略的启发,该协议试图开发一种简单有效的稳定肽的方法。此外,我们注意到稳定肽的侧链基团在空间上接近肽配体时可以与目标蛋白共价反应。2013年,戴明小组通过开发一种生产选择性修饰肽蛋氨酸27的新方法,填补了化学修饰Met的缺乏。基于这一背景,Shi等人重点研究了侧链闭环形成锍盐中心的发展。当肽配体与靶蛋白结合时,锍盐基团与空间接近的Cys蛋白共价反应。近年来,Shi等人设计了一种稳定环肽28的新方法。环肽上的锍盐被具有巯基的还原剂还原,该还原剂可逆地还原为Met。然而,该反应效率低,对后续的生物学应用研究有害。在目前的研究中,设计了Met-Cys和丙炔基溴-Cys闭环反应,在环肽的侧链上保留单个锍盐。锍盐充当了一种新的弹头,在空间接近下与蛋白质Cys共价反应。简而言之,Cys和Met突变的肽通过分子内烷基化环化,导致系绳上锍中心的产生。在这个过程中,侧链桥的形成对环肽至关重要。总体而言,该协议描述了使用简单的反应条件和操作实现的详细基于锍的肽环化。目的是为进一步广泛的生物学应用开发一种潜在的方法。
本文描述的合成方法提供了一种在肽序列中使用Cys和Met合成环肽的方法,其中基本线性肽通过常见的固相肽合成技术构建。对于Cys和Met之间环肽的双烷基化,整个合成路线可分为三个主要过程:Cys在树脂上的脱保护,接头的偶联以及Cys和Met在三氟乙酸裂解溶液中的环化。值得注意的是,Cys保护基团的去除被发现是随后闭环反应的关键步骤。因此,trt-Cys被去保护,直到溶液没有明显的黄色。进一步…
The authors have nothing to disclose.
感谢国家重点研发计划(2021YFC2103900)的资金支持;中国自然科学基金(21778009和21977010);广东省自然科学基金(2022A1515010996、2020A1515010521):深圳市科技创新委员会(RCJC20200714114433053、JCYJ201805081522131455、JCYJ20200109140406047);以及深港脑科学研究所-深圳基本科研机构资助(2019SHIBS0004)。作者感谢 化学科学, 皇家化学学会的期刊支持参考文献30和美国化学学会有机 化学杂志参考文献31。
1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
Formic acid | Energy | W810042 | |
High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
Methanol | Aldrich | 9758 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Triethylamine | Energy | B010737 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |