תרבית משותפת והתמרה של תימוציטים מורינים על תאי סטרומה דמויי דלתא המבטאים 4 כדי לחקור אונקוגנים בלוקמיה של תאי T

כל הניסויים המתוארים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של NIH (IBC) והוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (ACUC). עיין בטבלת החומרים לפרטים הקשורים לכל הריאגנטים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה. עיין בהנחיותשפורסמו 19 לקבלת פרטים נוספים על תרבית תאים מפיק רטרו-וירוס ונהלי תחזוקה. ראה איור 1 לקבלת סקירה כללית של הפרוטוקול. 1. התחלת תרבית תאי OP9-DL4 (יום 1) הפשירו תאי OP9-DL4 במהירות על ידי החזקת הבקבוקון וניעור עדין באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. העבר מיד את התאים לצינור צנטריפוגה המכיל 5 מ”ל של תווך OP9 (מדיום MEM-אלפא, 10% FBS, 50 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 55 מיקרומטר 2-מרקפטואתנול, 2 מ”מ L-גלוטמין) כדי להסיר את חומרי ההקפאה. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב-1 מ”ל של תווך OP9. הכניסו 5 מ”ל של OP9 בינוני לצלוחית T25, והוסיפו את התאים המרחפים לצלוחית זו. תרבית ב 37 ° C ו 5% CO2. לאחר 2-3 ימים, תרבית משנה של התאים באמצעות פיצול של 1:3 (עוברים את התאים בכל יום שני, רביעי ושישי).הערה: פצל את תאי OP9-DL4 לפני שהם מגיעים למפגש. בקבוק OP9-DL4 חייב להיות 80%-90% במפגש בימים 6-7 ובימים 8-9+ לתרבית משותפת עם תימוציטים. לכן, חשוב לתכנן כמה תאי OP9-DL4 יידרשו בימים אלה בעת פיצול תאי OP9-DL4.השליכו את המדיום מהצלוחית, ושטפו את המונושכבה עם 1x PBS. יש להשליך את PBS, להוסיף 1 מ”ל של 0.25% טריפסין, ולדגור במשך 1-5 דקות ב 37 ° C, או עד התאים נעקרו מן הצלוחית. חבטו בבקבוק כדי לעקור את התאים.הערה: (אופציונלי) ניתן לבדוק את התקדמות הדיסוציאציה של התא באמצעות מיקרוסקופיה. הוסף 5 מ”ל של מדיום OP9 כדי להשבית את הטריפסין, והשהה מחדש את התאים על ידי שטיפת פני השטח המכוסים בתאים של הבקבוק במהלך ההשעיה. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והשעיה מחדש ב 3 מ”ל של OP9 בינוני (עבור פיצול 1: 3). מניחים 1 מ”ל של תרחיף התא לתוך בקבוק T25 שכבר מכיל 5 מ”ל של תווך OP9 טרי. הקפא/השליך את התאים הנותרים.כדי להקפיא את תאי OP9-DL4, השהה מחדש את התאים ב- 90% FBS/10% DMSO ביחס של 1 מ”ל של מדיום הקפאה לבקבוקון אחד של תאים. יש להקפיא בקריובלים של 1 מ”ל בטמפרטורה של -80°C או בחנקן נוזלי, בהתאם לדרישות העתידיות. יש לאחסן בחנקן נוזלי לאחסון ממושך. 2. התחלת התרבית של קו התאים של יצרן רטרו-וירוס (יום 1) הפשירו את קו התאים של יצרן הרטרו-וירוס במהירות על ידי החזקת הבקבוקון וניעור עדין באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. העבר מיד את התאים לצינור צנטריפוגה המכיל 5 מ”ל של תווך תא יצרן רטרו-וירוס (RPC: DMEM, 10% FBS) כדי להסיר את סוכן cryoprotectant. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ”ל של מדיום RPC. מניחים 5 מ”ל של מדיום RPC לתוך בקבוק T25, ומוסיפים את התאים המרחפים לצלוחית זו. תרבית ב 37 ° C ו 5% CO2. עברו את התאים כל 2-3 ימים בפיצול של 1:5 עד 1:8.חבטו בבקבוק כדי לעקור את התאים, והשהו מחדש את התאים על ידי פיפטינג אגרסיבי.הערה: ניתן להסיר תאים אלה משטח הבקבוק על ידי פיפטינג אגרסיבי ללא טריפסין. לחלופין, טריפסיניזציה (0.05% טריפסין/0.53 מילימטר EDTA) עד שהתאים מתנתקים בקלות וניתן להפוך אותם בקלות לתרחיף חד-תאי. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות, והשהיה מחדש ב 5 מ”ל של RPC בינוני (עבור פיצול 1: 5). מניחים 1 מ”ל של תרחיף התא לתוך בקבוק T25 שכבר מכיל 5 מ”ל של מדיום RPC טרי. הקפא/השליך את התאים הנותרים. הקפיא את התאים המפיקים רטרו-וירוס באותו אופן המתואר עבור תאי OP9-DL4 (שלבים 1.4.4.1–1.4.4.2). 3. התחלת תרבית תאי יצרן הרטרו-וירוס בצלחות 6-באר (ימים 4-5) זרעו את התאים המפיקים רטרו-וירוס 18-24 שעות לפני הטרנספקציה במפגש של 70%-90% בכל באר של צלחת תרבית רקמה בת 6 בארות ב-2 מ”ל של תווך RPC, ודגרו ב-37°C ו-5% CO2.הערה: הדבק שתי בארות של תאים מפיקי רטרו-וירוס עבור כל 2-5 × 105 עד 1 × 106 תימוציטים שיותמרו. 4. הדבקת תאי הרטרו-וירוס המפיקים ליצירת הרטרו-וירוס המכיל את הגנים המעניינים (ימים 5-6) החלף את המדיום בתווך RPC טרי 1 שעה לפני ההעברה. הכינו תערובות ליפופקציה (לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות – הגדילו לפי הצורך): דללו 4 מיקרוגרם דנ”א (2 מיקרוגרם פלסמיד עוזר (pCL-Eco) ו-2 מק”ג פלסמיד העברה (pMIG) ב-250 מיקרוליטר של תווך סרום מופחת. מערבבים בעדינות. מערבבים 10 μL של מגיב transfection עם 250 uL של מדיום סרום מופחת משלב 4.2. דוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 5 דקות של דגירה, לשלב את ה- DNA מדולל עם מגיב transfection מדולל (נפח כולל = 500 μL). מערבבים בעדינות ודגרים במשך 20-25 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את 500 μL של תערובות מגיב DNA / transfection בעדינות לבאר המכילה את התאים המפיקים רטרווירוס על ידי ירידה על התאים בתנועה מעגלית. מערבבים בעדינות על ידי נדנוד הצלחת קדימה ואחורה, ודגרים על הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 16-24 שעות.הערה: תאים תת-פלואנטיים (80%-90%) הם המתאימים ביותר לטרנספקציה ועשויים לייצר את הטיטר הנגיפי הגבוה ביותר. מכיוון שהתאים המפיקים רטרו-וירוס נעקרים בקלות רבה מהצלוחית, הימנעו מתנועות פתאומיות בעת הטיפול בתאים אלה. 5. שינוי תווך התא המפיק רטרו-וירוס (ימים 6-7) החלף את המדיום הישן כ 16 שעות לאחר transfection עם 2 מ”ל של מדיום RPC טרי. המשך לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 20-24 שעות. להעריך את יעילות transfection תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אופציונלי).הערה: בפרוטוקול זה, תאים חיוביים ל-GFP הם התאים המעניינים (ראו איור 2). שלב זה תלוי בווקטור הרטרו-וירוס שנבחר לשימוש בפרוטוקול זה (האם גן מדווח נמצא בעמוד השדרה). 6. הכנת תימוציט ודלדול תאי CD4+ ו-CD8+ (ימים 6-7) קצרו את בלוטת התימוס מעכבר C57BL/6 בן 4-6 שבועות. לפרטים נוספים על קצירת בלוטת התימוס, ראו Xing and Hogquist20.הערה: עכברים הומתו על ידי שאיפת CO2 ואחריה נקע צוואר הרחם. הכינו תרחיף חד-תאי של תימוציט על-ידי הנחת בלוטת התימוס ב-5 מ”ל PBS בצלחת פטרי. בעזרת מגלשות זכוכית סטריליות, הניחו את בלוטת התימוס בין המשטחים החלביים של המגלשות, ושפשפו בעדינות את המגלשות זו בזו, תוך גלגול בלוטת התימוס בין שתי המגלשות. שטפו את שקופיות הזכוכית כדי לאסוף את התאים, והשליכו את שאריות רקמת הסטרומה התימית.הערה: התפוקה המשוערת מבלוטת תימוס אחת היא 90 × 10 6-100 ×10 6 תאים, וכ-1% מהתאים יישארו לאחר דלדול CD4 ו-CD8. השתמשו ברקמת בלוטת התימוס מעכברים צעירים יותר לתפוקה טובה יותר של תאים, שכן התאיות של בלוטת התימוס של העכבר בשבועות הראשונים לאחר הלידה עולה במהירות, מגיעה לרמה בגיל 4-6 שבועות, ובהדרגה מעוררת21. ספור את התאים באמצעות מונה תאי דם אוטומטי או כל שיטה חלופית. סננו את התרחיף התימי דרך מסנן של 30 מיקרומטר או 40 מיקרומטר על ידי פיפטציה של 5 מ”ל של התרחיף התימי דרך מסננת תאים. צנטריפוגה את התאים ב 300 × גרם במשך 10 דקות. הסר את supernatant, ו lyse את תאי הדם האדומים עם מאגר ליזה ACK על ידי הוספה (בהתאם לגודל הדגימה) 1 מ”ל של חיץ לכל צינור במשך 1 דקות. הוסף 5 מ”ל של מאגר דלדול תאים (500 מ”ל של PBS [pH 7.2], 0.5% BSA, 2 mM 0.5M EDTA, pH 8.0) כדי להשבית את מאגר ACK lysis, צנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 10 דקות, והשהה מחדש ב 1-5 מ”ל של מאגר דלדול התא לספירה.הערה: הניחו בצד את הדברים הבאים על קרח לפני דלדול (לפני דלדול): 70 μL של תרחיף תאים לספירה (שנו זאת בהתאם לשיטת תא הספירה שנבחרה) ו-200 μL של תרחיף תאים כדי לקבוע את יעילות הדלדול על ידי צביעה עבור CD4 ו-CD8 וניתוח לפי ציטומטריית זרימה22,23. ספרו את התאים ואת הצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות. השהה מחדש את התאים ב- 1 × 107/80 μL של מאגר דלדול תאים. הוסף 10 μL כל אחד של CD4 ו CD8 microbeads לכל 1 × 107 תאים. מערבבים היטב, ודגרים במשך 15 דקות בחושך במקרר (2-8 מעלות צלזיוס). הכינו עמוד דלדול על ידי שטיפתו ב-2 מ”ל של חיץ דלדול והשלכת הזרימה. שטפו את התאים משלב 6.6 על ידי הוספת 1-2 מ”ל של חיץ דלדול לכל 1 × 107 תאים, וצנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 10 דקות. הסר והשליך את הסופר-נטנט. השהה עד 1.25 × 108 תאים ב 500 μL של מאגר דלדול. החל את השעיית התא על העמודה ואסוף את הזרימה (תאים ללא תווית). שטפו את העמודה 2x עם 1 מ”ל של חיץ, ואספו את הזרימה.הערה: הוסף מאגר חדש רק כאשר מאגר העמודות ריק. הניחו בצד את הדברים הבאים על קרח לאחר דלדול (בקרת דלדול): 70 מיקרוליטר של תרחיף תאים לספירה (שנו זאת בהתאם לשיטת תא הספירה שנבחרה) ו-1,000 מיקרוליטר של תרחיף תאים כדי לקבוע את יעילות הדלדול על ידי צביעה עבור CD4 ו-CD8 וניתוח לפי ציטומטריית זרימה22,23. הכתימו את בקרות יעילות הדלדול על ידי פיצול 200 μL של תאים שנאספו לפני הדלדול לארבעה צינורות FACS: לא מוכתם, CD4 מוכתם יחיד, CD8 מוכתם יחיד ו- CD4 / CD8 מוכתם כפול (השתמש בדגימות לא מוכתמות ומוכתמות בודדות כדי להגדיר את פרמטרי ציטומטריית הזרימה). השתמשו ב-1,000 מיקרוליטר התאים שנאספו לאחר הדלדול כדי להכתים CD4 ו-CD8 והשוו עם הדגימה המוכתמת הכפולה שנאספה לפני הדלדול (ראו תוצאות דלדול אופייניות באיור 3).הערה: התאם את הנפחים לצביעת ציטומטריית זרימה בהתאם להמלצת יצרן הנוגדנים (לדוגמה, 1 μL של anti-CD4-FITC + 0.5 μL של anti-CD8-PE לכל 1 x 106 תאים ב 50 μL של חיץ). 7. גידול תימוציטים על תאי OP9-DL4 (ימים 6-7) הכניסו 2-5 × 10,5 עד 1 × 10,6 תימוציטים לאחר דלדול לתוך בקבוק T25 של 80%-90% תאי OP9-DL4 בזרם OP9 בתווך OP9 המכיל ציטוקינים (10 ng/mL רקומביננטי IL-7 ו-hFLT-3 רקומביננטי). תרבית ב 37 ° C ו 5% CO2. גדל במשך כ-24 שעות על תאי OP9-DL4.הערה: משך זמן זה נדרש כדי להפוך את תאי T לניתנים להמרה (ראו תוצאה טיפוסית באיור 4). שמור בקבוק T25 אחד של תרבית משותפת של תימוציטים ותאי OP9-DL4 לשימוש כבקרה (ללא טרנספורמציה). התימוציטים שלא עברו המרה יוכתמו יחד עם התימוציטים המומרים (שלב 9.1) כבקרה שלילית להערכת יעילות הטרנסדוקציה. תימוציטים לא מותמרים יכולים לשמש גם למדידת ההשפעה של ביטוי טרנסגנים על התמיינות תאים. יש להשליך את התווך המכיל ציטוקינים לאחר חודש. 8. קצירת הרטרו-וירוס מהסופרנאטנט ושימוש בו להעברת התימוציטים (ימים 8-9) אספו את הסופרנאטנט המכיל את הרטרו-וירוסים מהתאים הנגועים על ידי הטיית צלחת 6 בארות ומיקום מזרק 3-5 מ”ל בתחתית הצלחת תוך משיכת הבוכנה כדי לשאוף את הסופרנטנט. החלף את המדיום עם 2 מ”ל של מדיום RPC טרי. המשך לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 20-24 שעות עבור ההתמרה השנייה בשלב 8.9. מסננים את הסופרנאטנט רטרו-וירוס דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר, ואוספים את התסנין בצינור של 50 מ”ל.הערה: אין להקפיא את הסופרנטנט הרטרו-ויראלי. השתמש בהכנת וירוס טרי להתמרה. אספו תימוציטים מתרבית OP9-DL4 על ידי פיפטינג אגרסיבי כדי להסיר את תאי התימוציט ותאי OP9-DL4 מפני השטח של הבקבוק. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר את רוב תאי OP9-DL4, ואסוף את התסנין בצינור של 50 מ”ל.הערה: תאי OP9 דבקים מאוד. למרות שצנרת אגרסיבית עשויה להסיר חלק מתאי OP9-DL4 מהבקבוק, ההפרעה של החד-שכבה OP9-DL4 במהלך תהליך זה היא מינימלית, ותאי OP9-DL4 שיורדים יסוננו החוצה עם מסננת תאים של 40 מיקרומטר, מכיוון שתאי OP9-DL4 גדולים בהרבה מהתימוציטים הראשוניים. אם תאי OP9-DL4 עדיין חופפים ב-80%-90%, הסירו את התימוציטים, והכניסו אותם מחדש לאותה צלוחיות OP9-DL4. לחלופין, יש להכין בקבוק OP9-DL4 חדש. צנטריפוגה את התימוציטים בתסנין משלב 8.3 ב 300 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט. בצינור 50 מ”ל, להשעות מחדש את התימוציטים ב 0.5-1 מ”ל של OP9 בינוני + ציטוקינים (ראה שלב 7.1). הוסף 1-2 מ”ל של מדיום RPC המכיל את הנגיף (פי שניים מדיום RPC מאשר מדיום תימוציט). הוסף הקסמתרין ברומיד (ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם/מיקרוליטר) כדי להניב 8 מיקרוגרם של הקסמתרין ברומיד/מ”ל של תרחיף התאים הכולל. Spinoculate על ידי צנטריפוגה התאים ב 850 × גרם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את התאים ב-6 מ”ל של OP9 בינוני + ציטוקינים לכל בקבוק (ראה שלב 7.1), והוסף את המתלה בחזרה לחד-שכבה של תאי OP9-DL4.הערה: לחלופין, הצטיידו בצלוחיות OP9-DL4 חדשות מוכנות לקליטת התימוציטים המותמרים. אם רוצים להחזיר את התימוציטים לצלוחית OP9-DL4 משומשת, יש להקפיד להוסיף תווך OP9 טרי לתאי OP9-DL4 במהלך שעה אחת של ספינוקולציה של תימוציטים כדי לשמור על בריאות התאים ולהבטיח מפגש של 80%-90%. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה. חזור על שלבים 8.2-8.7 באמצעות באר חדשה של סופרנטנט התא המכיל רטרו-וירוס. 9. שמירה על תימוציטים מומרים בתרבית OP9-DL4 למשך 2-5 ימים או הקפאה לפי הצורך (יום 9+) הערך את התמיינות התימוציט על ידי ציטומטריית זרימה על ידי צביעת תימוציטים עבור סמני התפתחות תאי T כגון CD4, CD8, CD25 ו- CD4423. ראו תוצאות התמיינות טיפוסיות של תימוציטים באיור 5.