Dentro da pesquisa metabólica, o exame da termogênese do músculo esquelético é uma nova avenida promissora para sondar a homeostase do peso corporal. A literatura publicada apoia a ideia de que as respostas termogênicas de um dos maiores sistemas de órgãos do corpo – o músculo esquelético – fornecem uma avenida para o aumento do gasto energético e outros efeitos metabólicos, reequilibrando efetivamente os sistemas dentro de doenças como a obesidade ^1,2,3. Se o músculo pode ser considerado um órgão termogênico, os estudos devem utilizar uma metodologia prática para estudar as mudanças termogênicas dentro deste órgão. O desejo de compreender o impacto endotérmico dos músculos esqueléticos e a utilidade dessa metodologia para o estudo da termogênese muscular sem tremores não são específicos dos estudos metabólicos. Disciplinas como evolução⁴, fisiologia comparativa⁵ e ecofisiologia ^6,7 têm demonstrado interesse em compreender as maneiras pelas quais a termogênese muscular pode contribuir para a endotermia e como esse mecanismo se adapta ao ambiente. O protocolo apresentado fornece os métodos críticos necessários para abordar essas questões.

O método fornecido pode ser utilizado na avaliação da modulação da temperatura muscular por estímulos contextuais e farmacológicos, incluindo a técnica única de fornecer odor de predador (PO) para mudar o contexto para replicar a ameaça do predador. Relatos prévios demonstraram a capacidade do PO de induzir rapidamente um aumento considerável na termogênese muscular⁸. Além disso, os estímulos farmacológicos também podem alterar a temperatura muscular. Isso foi demonstrado no contexto da termogênese muscular induzida por PO, onde o bloqueio farmacológico dos receptores β-adrenérgicos periféricos, utilizando nadolol, inibiu a capacidade do PO de induzir termogênese muscular sem afetar significativamente a termogênese contrátil durante a caminhada em esteira⁸. A administração central de agonistas do receptor de melanocortina em ratos também tem sido utilizada para discernir mecanismos cerebrais que alteram a termogênese ^9,10.

Fornecido aqui é uma investigação preliminar da capacidade do neurohormônio oxitocina (Oxt) para alterar a termogênese muscular em camundongos. Semelhante à ameaça predadora, os encontros sociais com um conespecífico do mesmo sexo aumentam a temperatura corporal, fenômeno denominado hipertermia social¹¹. Dada a relevância do Oxt para o comportamento social¹², especula-se que o Oxt seja um mediador da hipertermia social em camundongos. De fato, um antagonista do receptor de ocitocina diminui a hipertermia social em camundongos¹¹, e filhotes de camundongos sem Oxt apresentam déficits em aspectos comportamentais e fisiológicos da termorregulação, incluindo a termogênese¹³. Dado que Harshaw et al. (2021) não encontraram evidências que apoiassem a termogênese do tecido adiposo marrom (BAT) dependente do receptor adrenérgico β3 com hipertermia social¹¹, tem sido postulado que a hipertermia social pode ser impulsionada pela indução de termogênese muscular de Oxt.

Para medir a termogênese do músculo esquelético, o protocolo a seguir utiliza o implante de transponders IPTT-300 pré-programados adjacentes ao músculo de interesse em camundongos ou ratos 8,10,14,15. Esses transponders são microchips encapsulados em vidro que são lidos usando leitores de transponder correspondentes. Pouca ou nenhuma pesquisa utilizou essa tecnologia nessa capacidade, embora estudos tenham sugerido a necessidade da especificidade proporcionada por esse método^16,17. Investigações anteriores mostraram a confiabilidade desse método e uma variedade de maneiras pelas quais os transponders de temperatura podem ser usados em comparação com outros métodos de teste de temperatura¹⁸ ou em conjunto com métodos cirúrgicos (por exemplo, canulação¹⁹). No entanto, estudos dessa natureza dependem de diferentes posicionamentos estratégicos para medir a temperatura corporal global 20,21,22 ou tecidos especificados, como a MTD^23,24,25.

Em vez de medir a temperatura a partir desses locais ou ao usar termômetros de orelha ou reto²⁶, o método descrito aqui fornece especificidade para o músculo de interesse. A capacidade de atingir um local implantando diretamente transponders adjacentes aos músculos de interesse é mais eficaz para sondar a termogênese muscular especificamente. Fornece uma nova avenida, além daquelas fornecidas pela termometria infravermelha de superfície ^27,28 ou medições de temperatura cutânea via termopar ²⁹. Além disso, os dados fornecidos por meio desse método oferecem uma gama de caminhos de pesquisa, evitando a necessidade de equipamentos e softwares de grande porte, caros e de alta tecnologia, como a termografia infravermelha^30,31,32.

Este método tem sido utilizado com sucesso para medir a temperatura no quadríceps e gastrocnêmio, unilateralmente ou bilateralmente. Esse método também tem sido eficaz em conjunto com a cirurgia estereotáxica^14,15. Dentro de ~7-10 cm do membro do transponder, leitores de transponder portáteis (DAS-8027/DAS-7007R) são usados para digitalizar, medir e exibir a temperatura. Essa distância tem sido crítica e valiosa para investigações anteriores ^8,9,10, pois minimiza potenciais estressores e variáveis que alteram a temperatura, como o manuseio de animais durante os procedimentos de teste. Usando temporizadores, as medições podem ser registradas e coletadas ao longo de um período de tempo sem interação direta com os animais.

Para minimizar ainda mais a perturbação dos ratos durante o teste, este método descreve a montagem e o uso de risers feitos de tubulação de PVC para dar ao experimentador acesso ao fundo das gaiolas domésticas durante o teste. Usando os risers em conjunto com o leitor digital, as medições de temperatura do membro do transponder podem ser feitas sem qualquer interação animal após a colocação do estímulo. A um custo mínimo, este método pode ser utilizado em conjunto com estímulos farmacológicos e contextuais, tornando-o bastante acessível para os pesquisadores. Além disso, este método pode ser empregado com um número substancial de indivíduos (~ 16 ratos ou ~ 12 ratos) de cada vez, economizando tempo no aumento da taxa de transferência geral para qualquer projeto de pesquisa.

Introduzido neste método é um mecanismo criado para apresentar odores a ratos usando bolas de infusor de chá de malha de aço inoxidável, a partir de agora referidas como “bolas de chá”. Embora essas bolas de chá sejam ideais para conter qualquer material de odor, nesses estudos, toalhas que serviram como cama na gaiola durante 2-3 semanas para furões, um predador natural de camundongos e ratos, são colocadas dentro de cada bola de chá de tratamento. Cada toalha é cortada em quadrados de 5 cm x 5 cm. Esta alíquota também é repetida com toalhas de controle inodoras idênticas. Apresentar esses odores sem barreira (ou seja, bola de chá) levou os ratos a triturar as fibras dentro de suas gaiolas, aumentando a atividade física. Esse comportamento não foi tão saliente em ratos. As bolas de chá fornecem um invólucro ventilado para a toalha, dando acesso total ao odor, mantendo-se protegidas durante todo o teste experimental. Essas bolas de chá podem ser higienizadas de acordo com os protocolos de uso animal, preparadas e introduzidas diretamente após a cirurgia para começar a habituar os animais à estrutura junto com o estímulo de controle. Os ratos podem então viver com o enriquecimento adicional, diminuindo a saliência da apresentação do estímulo agudo.

A habituação à presença da bola de chá é apenas um aspecto da habituação que é crítico para este método. O protocolo de habituação descrito também consiste na exposição repetida ao procedimento de teste para normalizar o ambiente de teste (ou seja, pessoal, transporte e movimento para o local de teste, exposição ao estímulo). Essa habituação prolongada minimiza as respostas matizadas dos animais e concentra as medições nas variáveis dependentes desejadas (por exemplo, estímulos farmacológicos ou contextuais). A avaliação prévia deste protocolo identificou quatro ensaios como o número mínimo de habituações necessárias antes do teste de temperatura dentro de gaiolas domésticas em ratos⁸. Se o teste for separado por longos períodos (mais de 2-3 semanas), os animais devem ser habituados novamente. Para habituação repetida, um mínimo de uma a duas tentativas são suficientes. No entanto, se os testes de temperatura forem separados por períodos de tempo mais prolongados, a repetição de mais ensaios pode ser necessária.

No esforço contínuo para acostumar camundongos e ratos ao procedimento de teste, um período de aclimatação antes da apresentação do estímulo deve ser incluído em cada ensaio experimental. Esse tempo de aclimatação é fundamental para reequilibrar a temperatura e a atividade depois de ser deslocado para o local de teste. Os roedores tendem a ter aumentos acentuados de temperatura devido à translocação. A aclimatação deve consistir em um mínimo de 1 h sem interação do experimentador no dia do teste antes de qualquer adição de um agente farmacológico ou estímulos contextuais. Isso é necessário a cada dia de teste.

Nos testes de temperatura da gaiola doméstica delineados, os ratos têm o alcance livre de sua gaiola doméstica para vagar em resposta ao estímulo testado. Isso pode causar mudanças variáveis na atividade, impactando a precisão das leituras de temperatura e, portanto, a análise dos efeitos termogênicos da variável independente (por exemplo, estímulo farmacológico ou contextual). Em reconhecimento às potenciais mudanças de temperatura devido ao nível de atividade, um protocolo é incluído abaixo descrevendo o uso da temperatura durante a caminhada em esteira. A literatura publicada descreve o uso bem-sucedido desse procedimento em ratos, e atualmente está sendo empregado com camundongos 8,10,14,15. A caminhada na esteira mantém uma velocidade constante de atividade para o sujeito do teste. Para este estudo, as esteiras são estritamente usadas para controlar o nível de atividade e, portanto, são ajustadas para a menor velocidade disponível na esteira para promover a caminhada para camundongos e uma configuração similarmente baixa para ratos.

O procedimento a seguir é descrito para a medição da temperatura do gastrocnêmio unilateral em camundongos e apresentação de odor de predador. O desenho pode ser usado em conjunto com agentes farmacológicos e é transferível para ratos e outros grupos musculares esqueléticos (ou seja, quadríceps) em camundongos. Para ratos, os transponders podem ser colocados no gastrocnêmio bilateralmente e no tecido adiposo marrom. Devido a limitações de tamanho e distância, apenas um transponder pode ser usado por mouse. Pequenas modificações (por exemplo, a remoção de estímulos contextuais) podem ser feitas para avaliar as respostas termogênicas a agentes farmacológicos.