Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ
Summary
Salmonellen dringen in intestinale Epithelzellen ein und replizieren sich sowohl in Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (Hyperreplikation). Hier wird ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll beschrieben, um die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen durch zwei komplementäre Bildanalysen durch ImageJ zu quantifizieren, um Einzelzellauflösung und Scoring zu erreichen.
Abstract
Salmonellen sind ein enterischer Erreger, der in das Darmepithel eindringen und sich in Enterozyten vermehren kann, sowohl innerhalb von Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (zytosolische Hyperreplikation). Diese verschiedenen Phänotypen der intrazellulären Replikation treiben zu verschiedenen Wegen der Pathogenese, d.h. zytosolische Hyperreplikation induziert den entzündlichen Zelltod und die Extrusion in das Darmlumen, während die vakuoläre Replikation zu einer Transepithelpenetration und systemischen Ausbreitung führt. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Mikroskopiewerkzeuge zu entwickeln, um das Verhalten von Salmonellen in eingedrungenen Zellen zu untersuchen, wie das pCHAR-Duo-Fluoreszenzreporterplasmid, das eine Unterscheidung zwischen vakuolären und zytosolischen Bakterien durch differentielle Expression von mCherry und GFP ermöglicht. Intrazelluläre Phänotypen werden jedoch oft manuell bewertet, ein zeitaufwendiges Verfahren, das die Analyse auf eine kleine Anzahl von Proben und Zellen beschränkt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen mit ImageJ, einer frei verfügbaren Bildanalysesoftware, entwickelt. Im Hochdurchsatzprotokoll wurden Epithelzellen mit Salmonellen infiziert, die pCHAR-Duo unter Verwendung von 96-Well-Platten trugen. Die Bildgebung erfolgte mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop. Anschließend wurden zwei Bildanalysemethoden angewendet, um das intrazelluläre Verhalten von Salmonellen auf verschiedenen Detailebenen zu messen. Die erste Methode misst die gesamte intrazelluläre Bakterienbelastung und das Ausmaß der zytosolischen Hyperreplikation. Es ist schnell und ermöglicht die Bewertung einer hohen Anzahl von Zellen und Proben, wodurch es für Hochdurchsatz-Assays wie Screening-Experimente geeignet ist. Die zweite Methode führt Einzelzellanalysen durch, um den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Belastung von Salmonellen und die zytosolische Hyperreplikationsrate zu bestimmen, die mehr Details über das Verhalten von Salmonellen in Epithelzellen liefern. Die Protokolle können von speziell entwickelten ImageJ-Skripten durchgeführt werden, um automatisch Batch-Analysen der wichtigsten Schritte der Salmonella-Enterozyten-Interaktion durchzuführen.
Introduction
Salmonellen sind der am häufigsten gemeldete bakterielle Erreger, der Ausbrüche lebensmittelbedingter Krankheiten in der Europäischen Union verursacht1. Die primäre pathologische Manifestation der Salmonelleninfektion ist die Enteritis, die das Ergebnis des Erregerverhaltens im Darm nach der Einnahme und der daraus resultierenden lokalen Entzündungsreaktion ist2. Salmonellen können sich jedoch auch an extraintestinalen Stellen ausbreiten und systemische Infektionen verursachen, insbesondere bei immungeschwächten Personen. Die Art der Interaktion zwischen Salmonellen und dem Darmepithel bedingt das Ergebnis der Infektion. Einmal im Darmlumen dringt Salmonella in Darmepithelzellen ein und repliziert sich. Auf intrazellulärer Ebene können Salmonellen zwei verschiedene Replikationsphänotypen aufweisen, die zytosolische Hyperreplikation und die intravakuoläre langsame Replikation innerhalb von Salmonellen-haltigen Vakuolen (SCVs). Die zytosolische Hyperreplikation induziert den entzündlichen Wirtszelltod und die Salmonellenextrusion in das Darmlumen3; Die vakuoläre Replikation führt zu einer Transepithelpenetration und systemischen Ausbreitung4. Daher beeinflusst das Ausmaß der Invasion und der vakuolären vs. zytosolischen Replikation den Verlauf der Infektion.
Die Gattung Salmonella ist sehr vielfältig, darunter Tausende von Serotypen mit unterschiedlichen Wirtsbereichen und Fähigkeiten, Krankheiten zu verursachen. Beispiel: S. Typhimurium wird als generalistisches Serovar definiert, da es mehrere nicht verwandte Wirte infiziert und eine der Hauptursachen für menschliche Salmonellose darstellt. Anders, S. Derby gilt als schweineangepasster Serovar, da es meist von den Schweinen isoliert ist, aber es wird auch in den Top fünf der Serovare berichtet, die für die Infektion des Menschen verantwortlich sind1. Das Wissen über das bakterielle Verhalten innerhalb der Epithelzellen beschränkt sich jedoch im Wesentlichen auf die Untersuchung einiger weniger Referenzstämme, wie S. Typhimurium SL1344, die nicht die große natürliche Vielfalt der Salmonellenpathogenität repräsentieren. Die Charakterisierung der Interaktion verschiedener Salmonellenstämme mit Epithelzellen würde zum Verständnis ihrer unterschiedlichen Pathogenität beitragen. Aus diesem Grund wurde ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll entwickelt, um das intrazelluläre Verhalten einer großen Anzahl von Stämmen schnell und weitgehend automatisiert zu analysieren. In diesem Protokoll wurde die Infektion von Epithelzellen in 96-Well-Bildgebungsplatten durchgeführt und die Bildaufnahme wurde mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Das pCHAR-Duo-Plasmid wurde verwendet, um die Invasions- und Replikationsphänotypen von Salmonellen in Epithelzellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten5. Dieses Plasmid trägt das Gen, das für den rot fluoreszierenden Reporter mCherry kodiert, der konstitutiv von allen transformierten Bakterienzellen exprimiert wird, und das Gen, das für den grün fluoreszierenden Reporter GFP kodiert, dessen Expression durch Glucose-6-phosphat aktiviert wird, das ausschließlich im Zytosol eukaryotischer Zellen vorhanden ist und in SCVs fehlt. Daher ermöglicht das Plasmid die Unterscheidung zwischen vakuolären und zytosolischen Bakterien durch differentielle Expression von mCherry- und GFP-Reportern.
Die vakuolären und zytosolischen Bakterien auf Mikroskopiebildern werden üblicherweise durch manuelles Scoring6 quantifiziert, aber dies ist eine zeitaufwändige Methode, die die Analyse auf eine kleine Anzahl von Proben beschränkt. Daher wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen entwickelt – die Flächenanalyse und die Einzelzellanalyse – mit ImageJ7, einer frei verfügbaren Bildanalysesoftware. Die Flächenanalyse misst die gesamte intrazelluläre Bakterienlast und das Ausmaß der zytosolischen Hyperreplikation unter Verwendung von Daten von Bereichen, die von Epithelzellen, roten und grünen Salmonellen in jedem aufgenommenen Mikroskopiebild besetzt sind. Diese Methode kann auf Bilder angewendet werden, die bei geringer Vergrößerung aufgenommen wurden. Daher ermöglicht es, eine hohe Anzahl von Epithelzellen mit wenigen Bildern zu bewerten, wodurch die Erfassungszeit verkürzt wird. Die Einzelzellanalyse verwendet die Zellsegmentierung, um den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Belastung und den Prozentsatz der infizierten Zellen zu bestimmen, die eine zytosolische Hyperreplikation mit Einzelzellauflösung durchlaufen.
In diesem Protokoll werden alle Schritte der Bildanalyse detailliert beschrieben, um manuell durchgeführt zu werden, aber die gleiche Analyse kann durch unsere speziell entwickelten ImageJ-Skripte automatisiert werden. Diese Skripte ermöglichen auch die Durchführung von Batch-Analysen, um mehrere Bilder automatisch zu analysieren und so die Ausführung der Methode zu beschleunigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Art und Weise, wie Salmonellen Darmepithelzellen besiedeln, beeinflusst das Infektionsergebnis. Bei der Invasion induziert die zytosolische Hyperreplikation eine Entzündung des Darms3, während die vakuoläre Replikation zu einer systemischen Ausbreitung führen kann4. Salmonellenstämme können in ihrer Fähigkeit variieren, in intestinale Epithelzellen einzudringen und sich darin zu vermehren9. Tatsächlich sind Salmonellen eine äußerst vielfältige Gattung mit mehr als 2.500 Serovaren, die unterschiedliche Fähigkeiten haben, Krankheiten zu verursachen. Darüber hinaus sind Salmonellen die am häufigsten gemeldete Ursache lebensmittelbedingter Krankheitsausbrüche in der Europäischen Union, was auf eine starke Ausbreitung in der menschlichen Bevölkerung hindeutet1. Daher ist die Verfügbarkeit zuverlässiger Hochdurchsatzmethoden zur Quantifizierung der intrazellulären Phänotypen von Salmonellen von großer Bedeutung, um Unterschiede in der Virulenz zwischen einer großen Anzahl von Salmonella-Stämmen zu bewerten und letztendlich eine genaue und stammspezifische Risikobewertung dieses Erregers zu ermöglichen.
Das hier beschriebene Protokoll misst das Verhalten von Salmonellen in Epithelzellen schnell und automatisiert. Die Infektion von Epithelzellen wird in 96-Well-Bildgebungs-Mikrotiterplatten durchgeführt und ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop wird für die Bildaufnahme verwendet, wodurch das Protokoll für Hochdurchsatzanwendungen geeignet ist. Dieses Protokoll nutzt das pCHAR-Duo-Plasmid, das es ermöglicht, vakuoläre von zytosolischen Salmonellen durch die differentielle Expression von zwei fluoreszierenden Reportern zu unterscheiden5. Die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen werden häufig durch manuelles Scoring analysiert, ein zeitaufwändiges Verfahren, das für die Analyse einer großen Anzahl von Stämmen und Zellkulturen pro Stamm ungeeignet ist und anfällig für Bedienerfehler und Variationen zwischen den Bedienern ist. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen entwickelt, die Flächenanalyse und die Einzelzellanalyse. Für die Entwicklung der beiden Analysen wurde ImageJ verwendet, eine frei verfügbare Software. Um die Protokollausführung zu beschleunigen, werden ImageJ-Skripte für die Batch-Analyse mehrerer Erfassungsdateien ohne Bedienereingriff als ergänzende Dateien bereitgestellt.
Die Flächenanalyse wurde entwickelt, um in wenigen Schritten die Gesamtbesiedlung von Epithelzellen (Infektionsrate) und das Hyperreplikationsniveau (Hyperreplikationsverhältnis) durch die Messung der Bereiche, die spezifisch von den Kernen von Epithelzellen besetzt sind, und durch Salmonellen , die entweder mCherry oder mCherry zusammen mit GFP exprimieren, zu quantifizieren. Die Flächenanalyse wird auf Bilder angewendet, die bei geringer Vergrößerung aufgenommen wurden, wobei sowohl vakuoläre als auch hyperreplizierende Salmonellen in derselben z-Ebene fokussiert sind und eine große Anzahl von Epithelzellen pro mikroskopischem Feld angezeigt wird, wodurch die Größe und Anzahl der Erfassungsdateien reduziert wird. Die Flächenanalyse ermöglicht eine automatisierte, schnelle und rechnerisch leichte Analyse einer großen Anzahl von Proben und eignet sich daher für Hochdurchsatz-Assays wie Screening-Experimente.
Die Einzelzellanalyse wurde entwickelt, um Salmonella-Phänotypen in Epithelzellen mit Einzelzellauflösung zu quantifizieren, die durch Zellsegmentierung und Messung des Zellbereichs und des Prozentsatzes der Fläche, die von vakuolären und zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen eingenommen wird, erhalten wird. Die Gesamtkolonisation von Epithelzellen, die durch die Flächenanalyse charakterisiert wird, wird hier in drei quantitative Parameter unterteilt, den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Last und die Hyperreplikationsrate, so dass der Beitrag jedes Phänotyps zur Gesamtkolonisation bewertet und quantifiziert werden kann, wodurch die Ergebnisse der Flächenanalyse ergänzt werden. Die größeren Details, die die Einzelzellanalyse bietet, gehen zu Lasten einer langsameren Bildaufnahme und -analyse. Um eine Einzelzellauflösung zu erreichen, wird die Bildaufnahme bei hoher Vergrößerung durchgeführt. Dies bedeutet, dass mehrere z-Ebenen benötigt werden, um sowohl vakuoläre als auch zytosolische Salmonellen im Fokus zu beobachten, und dass die Erfassung einer großen Anzahl von Feldern pro Probe erforderlich ist, um eine hohe Anzahl von Epithelzellen zu erzielen, wodurch die Erfassungszeit im Vergleich zur Flächenanalyse verlängert wird. Darüber hinaus ist die Analyse mehrerer großer Erfassungsdateien rechenintensiv und erfordert daher eine geeignete Workstation (es wurde eine 6-Core-Workstation mit 32 GB RAM verwendet). Daher kann die Einzelzellanalyse als eigenständige Methode unter begrenzten Durchsatzbedingungen oder als Second-Level-Methode in Verbindung mit der Flächenanalyse eingesetzt werden, um ein tieferes Verständnis der Salmonella-Phänotypen in Epithelzellen zu erlangen.
Die beiden komplementären Analysen wurden mit S validiert. Tm, S. Derby wt, und S. Derby ΔsipA, gewählt, weil ihr Verhalten in Epithelzellen bereits bekannt war, um sich in Bezug auf Invasion oder Replikation zu unterscheiden 9,10. Die Ergebnisse der Flächen- und Einzelzellanalysen zeigen, dass das Protokoll es erlaubte, Unterschiede in intrazellulären Salmonella-Phänotypen entsprechend den Eigenschaften der getesteten Stämme quantitativ zu unterscheiden. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass die Einzelzellanalyse eine Quantifizierung des Beitrags jedes intrazellulären Phänotyps (Invasion, vakuoläre Last und zytosolische Replikation) zur Gesamtkolonisation ermöglicht, die mit Hilfe der Flächenanalyse bewertet wird.
Dieses Protokoll wurde hier angewendet, um die In-vitro-Pathogenität verschiedener Salmonellenstämme zu untersuchen, aber es kann auch andere Anwendungen haben, wie die Untersuchung zufälliger Mutanten, um Gene zu identifizieren, die an der Invasion und / oder Replikation in Epithelzellen beteiligt sind. Darüber hinaus kann das Protokoll angepasst werden, um das Verhalten von Salmonellen in anderen Zelllinien als INT407-Zellen zu analysieren. Es kann auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung ähnlicher Methoden zur Untersuchung der Zell-Pathogen-Interaktion anderer intrazellulärer Mikroorganismen verwendet werden.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Olivia Steele-Mortimer für das Teilen von pCHAR-Duo-Plasmid. Diese Arbeit wurde vom italienischen Gesundheitsministerium finanziert, gewährt PRC2019014 und PRC2021004.
Materials
| 96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
| Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
| Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
| Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
| Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
| Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
| Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
| HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
| Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
| Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
| Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
| Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
| Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
| Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
| Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
| Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |
Referências
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