Uso dell'imaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante l'infezione attiva de un ospite di mammifero

Gli studi in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) dell’Università dell’Iowa. Fare riferimento alle linee guida CDC per le attrezzature e le procedure per lavorare con organismi BSL213. 1. Preparazione dei ceppi di Candida albicans Identificare un ceppo di riferimento appropriato da utilizzare come controllo positivo. Assicurarsi che questo ceppo corrisponda strettamente ai ceppi sperimentali in termini di lignaggio e manipolazioni genetiche.NOTA: Per gli esperimenti rappresentativi qui presentati, i mutanti sono stati creati dai ceppi descritti in Homann, et al.14, che sono stati costruiti da SN152. Questi mutanti sono Arg-. Pertanto, il ceppo di riferimento selezionato era SN250, anch’esso creato da SN152 ed è anche Arg-. I fattori di stress nutrizionale sono fondamentali nella regolazione della crescita polarizzata nel lievito Saccharomyces cerevisiae15; sono stati anche implicati nella filamento in C. albicans e altri funghi16,17,18. Pertanto, il ceppo di riferimento deve essere abbinato per gli auxotrofi con i ceppi sperimentali ogniqualvolta possibile per evitare potenziali effetti confondenti da stress nutrizionale. Scegli costrutti di espressione proteica fluorescente. Quando si esegue lo screening di una varietà di ceppi sperimentali, creare un ceppo di riferimento che esprima una proteina fluorescente e utilizzare altre proteine fluorescenti per marcare i ceppi mutanti.NOTA: I dati rappresentativi qui presentati utilizzano NEON per il ceppo di riferimento e iRFP per i ceppi mutanti. Qualsiasi proteina fluorescente può essere utilizzata se è altamente espressa, relativamente luminosa e in grado di essere eccitata / rilevata dal microscopio utilizzato. Esperimenti di controllo che confrontano ceppi di riferimento che esprimono diverse proteine fluorescenti non hanno dimostrato alcun impatto dell’espressione delle proteine fluorescenti sulla morfogenesi. Trasforma i ceppi con costrutti di espressione proteica fluorescente.NOTA: Molte istituzioni richiedono l’uso di precauzioni di livello 2 di sicurezza biologica per lavorare con C. albicans. Tutto il lavoro deve seguire le norme di sicurezza locali. Indipendentemente dalle normative locali, i ricercatori che lavorano con C. albicans devono essere addestrati alla manipolazione sicura dell’organismo.Trasformare i ceppi di riferimento e sperimentali utilizzando protocolli standard di acetato di litio19.NOTA: Gli esperimenti qui descritti utilizzano i plasmidi pENO1-NEON-NAT R e pENO1-iRFP-NATR, generosamente forniti dal Dr. Robert Wheeler11,12. I plasmidi sono stati linearizzati usando NotI9. Selezionare i trasformanti in base alla crescita su nourseotricina o altro mezzo di selezione pertinente. Identificare i trasformanti di successo. Scegli una piccola dose di cellule da ogni colonia usando uno stuzzicadenti e poi mescolale in una goccia d’acqua da 2,5 μL su un vetrino da microscopio. Applicare un coprivetrino ed esaminare con ingrandimento 10x-40x. Esaminare con un sistema di imaging confocale (utilizzato per il resto del protocollo) o qualsiasi microscopio a fluorescenza a campo largo standard. I trasformanti appropriati avranno un segnale luminoso con lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione appropriate.NOTA: Per i risultati rappresentativi, i ceppi espressi NEON sono stati visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza verticale con un filtro passa-lungo impostato con un filtro di eccitazione passa banda 472/30 nm, un filtro di emissione passa banda 520/35 nm e uno splitter a fascio dicroico a bordo singolo da 495 nm. Poiché iRFP non è visibile ad occhio, le tensioni espresse da iRFP sono state visualizzate utilizzando il sistema di microscopia confocale utilizzato per l’imaging in vivo , utilizzando un laser a 638 nm per l’eccitazione e rilevando la luce di emissione da 655-755 nm.In alternativa, valutare la fluorescenza macroscopica delle colonie utilizzando la stereomicroscopia a fluorescenza, i sistemi di eccitazione della fluorescenza portatili o i sistemi di rilevamento della fluorescenza tipicamente utilizzati per gel e macchie occidentali. Crea scorte congelatrici di trasformanti selezionati. Inoculare i terreni solidi YPD (estratto di lievito peptone destrosio) con un riferimento fluorescente che esprime proteine e ceppi sperimentali da scorte congelatrici 3 giorni prima dell’iniezione, utilizzando uno stuzzicadenti per trasferire un tampone di organismi dal congelatore al terreno solido YPD. Incubare a 30 °C per 2 giorni. Per ogni ceppo, inoculare un matraccio contenente 25 mL di YPD con cellule di C. albicans prelevate da diverse colonie 1 giorno prima dell’iniezione. Fallo usando uno stuzzicadenti per trasferire un tampone di organismi da una colonia nell’YPD; Ripeti più volte per ottenere cellule da diverse colonie. Incubare per una notte a 30 °C in un incubatore orbitale a 175 giri/min.NOTA: È importante utilizzare più colonie come fonte per l’inoculo perché C. albicans ha un’alta frequenza di alterazioni genetiche spontanee. L’uso di più colonie quando si avvia la coltura dell’inoculo riduce al minimo la possibilità che tutti gli organismi nell’inoculo derivino da un genitore con significative alterazioni spontanee. Il giorno dell’iniezione:Centrifugare 1 mL di coltura per 2 min a 500 x g. Lavare la coltura tre volte con 1 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco (dPBS). Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in 1 mL di dPBS sterile. Diluire un campione della coltura lavata a 1:100 e contare utilizzando un emocitometro. Regolare la densità della coltura lavata a 1 x 108 organismi per ml utilizzando dPBS. Per ogni serie di ceppi da iniettare, creare l’inoculo mescolando volumi uguali del ceppo di riferimento e dei ceppi sperimentali. Questo mantiene la densità dell’inoculo a 1 x 108 organismi per ml.NOTA: Il numero di ceppi che possono essere valutati per orecchio è limitato dalla capacità del sistema di microscopia utilizzato di discriminare chiaramente il segnale di ciascuna proteina fluorescente. Una volta preparato l’inoculo, procedere direttamente alle iniezioni di animali. Non conservare l’inoculo prima dell’uso. 2. Preparazione degli animali Ottenere l’approvazione del comitato istituzionale locale per la cura e l’uso degli animali o dell’organo di governo locale competente. Ottieni topi di 6-12 settimane da un fornitore o da un programma di allevamento. Topi domestici nella struttura in cui vivranno durante l’esperimento per almeno 1 settimana prima dell’inoculazione.NOTA: Per i risultati rappresentativi, sono stati utilizzati topi DBA2/N femmina di 6 settimane. Nutrire gli animali senza chow senza clorofilla per almeno 7 giorni prima dell’inoculazione. 3. Depilazione e inoculazione Indurre un piano chirurgico di anestesia (Figura 1).ATTENZIONE: Gli agenti anestetici inalati sono materiali pericolosi e possono causare irritazione agli occhi o alla pelle, nonché tossicità del sistema nervoso. Devono essere seguite tutte le politiche e le procedure istituzionali e le pratiche generali di sicurezza del laboratorio per l’uso di anestetici inalati. Solo gli individui addestrati all’uso di anestetici per via inalatoria possono eseguire questi passaggi. Le pratiche standard includono l’uso di guanti, un camice da laboratorio, la protezione degli occhi, l’uso di un sistema di spazzino per anestesia e un’attenta tenuta dei registri secondo le linee guida istituzionali.Posizionare un topo in una camera di induzione per anestesia preriscaldata. Tenere l’animale in un ambiente caldo durante l’anestesia generale. Realizza questo utilizzando cuscinetti riscaldanti progettati per questo scopo e uno stadio di microscopio riscaldato. Non utilizzare una piastra riscaldante da banco in quanto può surriscaldarsi e causare ustioni. Fornire isoflurano al 2% -3% alla camera di induzione fino a quando il topo non ha perso il riflesso raddrizzante e la respirazione è lenta e costante. Eliminare la camera di induzione dell’anestesia e trasferire l’animale in un cono nasale senza rebreather che fornisca l’1% -2% di isoflurano. Convalidare il piano dell’anestesia utilizzando il riflesso del pizzico della punta o altri meccanismi di verifica. Durante l’esperimento, monitorare il modello respiratorio e il piano anestetico dell’animale e regolare la concentrazione di anestetico secondo necessità. Applicare lubrificante per gli occhi per prevenire l’essiccazione corneale. Depilazione (Figura 1C,D)Applicare una crema depilatoria da banco liberamente sulla superficie interna ed esterna di entrambe le orecchie utilizzando un batuffolo di cotone. Dopo 2-3 minuti (o secondo le indicazioni del produttore), pulire delicatamente l’orecchio con una garza asciutta per rimuovere tutta la crema e i capelli. Pulire altre due volte con tamponi di garza saturi di acqua sterile per rimuovere completamente i residui di crema depilatoria. La mancata rimozione di tutta la crema depilatoria provocherà irritazione / infiammazione della pelle. Iniezione (Figura 1E, F)Pulire la superficie dell’orecchio da iniettare con una garza satura di etanolo al 70% e lasciare asciugare all’aria. Mescolare bene l’inoculo invertendo più volte o vortice. Aspirare 20-30 μL di inoculo in una siringa da insulina. Tenendo l’ago rivolto verso l’alto, picchiettare delicatamente la siringa per assicurarsi che l’aria nella canna sia nella parte superiore. Espellere con cautela l’aria e l’inoculo in eccesso nel tubo dell’inoculo o in un tubo di scarico in modo che lo stantuffo sia al segno di 10 μL. Indossando un ditale su un dito o un pollice della mano non dominante, stabilizzare l’orecchio avvolgendolo attraverso il ditale. In alternativa, applicare il nastro biadesivo da banco (nastro di moda) su un piccolo tubo di plastica conico o rotondo e drappeggiare l’orecchio sul nastro. Fare attenzione a non rimuovere il cono del naso dell’anestesia mentre lo fai. Può essere utile fissare il naso al piano di lavoro.NOTA: Il lato interno o esterno dell’orecchio può essere iniettato in base al comfort fisico dello sperimentatore. Per la microscopia, assicurarsi di posizionare il mouse in modo che il lato dell’orecchio iniettato sia rivolto verso la lente dell’obiettivo. Mantenendo l’ago della siringa quasi completamente parallelo alla pelle ed evitando vene grandi, inserire la punta dell’ago nello strato più esterno della pelle fino a coprire la smussatura. Iniettare lentamente l’inoculo per via intradermica. Una buona iniezione intradermica solleverà una piccola bolla nella pelle. Tenere l’ago in posizione per 15-20 secondi prima di rimuoverlo dall’orecchio per ridurre al minimo le perdite.Se il lato inferiore dell’orecchio dell’animale diventa umido, l’ago era troppo profondo e passava interamente attraverso l’orecchio. In tal caso, ripetere l’iniezione in un’area diversa dell’orecchio. Ripeti il processo usando l’altro orecchio dell’animale. Questo può essere fatto con gli stessi ceppi di C. albicans per una replica o con un diverso insieme di ceppi di C. albicans. Se non si esegue immediatamente l’imaging, posizionare l’animale in una camera di recupero riscaldata. Osservare l’animale fino a quando non si è ripreso dall’anestesia e poi riportarlo nella sua gabbia abitativa. Seguendo i protocolli istituzionali, contrassegnare chiaramente la gabbia con etichette di rischio biologico e indicare che gli animali nella gabbia sono infetti da Candida albicans. Completare tutti i registri richiesti relativi all’anestesia animale e qualsiasi altra pratica istituzionale richiesta. Ospitare l’animale in condizioni di struttura per animali utilizzando le precauzioni di sicurezza biologica animale di livello 2. 4. Quantificare la morfogenesi in vitro per il confronto con i risultati in vivo Utilizzando le stesse colture lavate utilizzate per preparare l’inoculo, creare una diluizione 1:50 di organismi in RPMI1640 + siero bovino fetale inattivato termicamente al 10% e incubare a 37 °C con burattatura per 4 ore. In alternativa, possono essere utilizzati altri mezzi che stimolano la morfogenesi in vitro . Centrifugare il campione per 5 minuti a 500 x g e risospendere in 0,5 mL di dPBS. Diluire il campione in un rapporto di 1:10, posizionare 2,5 μL del campione diluito su un vetrino da microscopio e coprirlo con un vetrino di copertura. Esaminare il campione utilizzando un microscopio a fluorescenza. Contare almeno 100 cellule, registrando il numero di lieviti e cellule filamentose per ogni ceppo. Nei risultati rappresentativi qui presentati, una cellula filamentosa è definita come qualsiasi cellula con una lunghezza superiore al doppio della lunghezza della cellula madre.NOTA: La quantificazione della morfogenesi in vitro può essere effettuata lo stesso giorno dell’inoculazione degli animali. È possibile iniziare il saggio di morfogenesi in vitro durante la preparazione dell’inoculo per l’iniezione ed eseguire l’inoculazione degli animali durante il periodo di incubazione di 4 ore. Se tutte le procedure animali sono completate prima della fine del periodo di incubazione di 4 ore, procedere direttamente all’esame delle cellule stimolate in vitro . In alternativa, le cellule possono essere risospese in formaldeide al 3,7% in dPBS (nella fase 4.2) e conservate a 4 °C per diversi giorni. Gli organismi fissi possono quindi essere quantificati come il tempo lo consente. L’inoculazione degli animali non deve essere ritardata per il test di quantificazione in vitro . 5. Preparazione per l’imaging in vivo Preparare il microscopio (Figura 2A).Accendere tutte le apparecchiature di microscopia e avviare il software di imaging.Se disponibili, caricare eventuali impostazioni di imaging predeterminate. Attivare i laser e i rilevatori necessari per rilevare le proteine fluorescenti utilizzate. Accendere lo stadio del microscopio riscaldato e lasciarlo riscaldare a 37 °C.NOTA: È possibile utilizzare un microscopio con una camera ambientale completamente chiusa piuttosto che un palco riscaldato. Impostare un punto di riferimento dell’asse z con il piano di messa a fuoco sulla superficie superiore del vetrino.  Questo può essere fatto fissando un copriletto in posizione sopra l’apertura del palco e mettendo una goccia d’acqua sul vetrino di copertura.  Utilizzare un obiettivo “a secco” con ingrandimento inferiore (10x) per mettere a fuoco il bordo della goccia d’acqua, quindi impostare il punto di riferimento dell’asse z.  Usa un pezzo di spugna per assorbire l’acqua dal coprislip prima di rimuoverlo dal palco. Ruotare l’obiettivo a distanza di lavoro molto lunga in posizione e posizionare una goccia di fluido di immersione sull’obiettivo. Abbassare la lente per evitare possibili danni quando si posiziona il vetrino. Posiziona una copertina #1.5 sopra l’apertura del palco e fissala in posizione. Assicurarsi che il nastro copra completamente tutti i bordi del vetrino per evitare che il fluido penetri al microscopio sotto il vetrino. Portate l’obiettivo al punto di riferimento dell’asse z in modo che il fluido di immersione sia a contatto sia con l’obiettivo che con il vetrino. Preparare più pezzi di nastro adesivo sensibile alla pressione in modo che siano pronti all’uso quando si posizionano il naso e il mouse. Indurre l’anestesia generale nel mouse per essere ripreso come sopra (punto 3.1). Posizionare il mouse (Figura 2B-D).Fissare un cono naso per anestesia sullo stadio del microscopio con il cono nasale posizionato in modo che copra completamente il naso dell’animale quando l’animale è in posizione per l’imaging. Questo può essere realizzato più facilmente con due investigatori. Chiedi al primo investigatore di posizionare il naso del topo anestetizzato nel naso e spostare il topo in posizione per l’imaging continuando a tenere il naso sopra il naso dell’animale. Chiedi all’altro investigatore di fissare il naso e il tubo in posizione in modo che si sieda stabilmente sopra il naso del topo. Una volta che il naso è stato registrato in posizione, lasciarlo lì per il resto della sessione di imaging. Dopo aver stabilito il posto migliore per posizionare il nosecone, notare la sua posizione. Per le successive sessioni di imaging, il naso può essere fissato allo stadio prima di portare un animale al microscopio. Posizionare una goccia di acqua sterile sul coprivetrino sopra l’obiettivo. Posizionare il mouse sul palco del microscopio. Assicurarsi che l’orecchio sia sopra la goccia d’acqua e piatto contro il coprifoglio. Utilizzare un secondo coprislip (superiore) per appiattire l’orecchio.Posizionare il bordo della copertina parallelamente al corpo del mouse, con il bordo che tocca il mouse nel punto in cui l’orecchio incontra la testa. Abbassare il bordo libero del coprivetrino allo stadio del microscopio con un movimento della cerniera. Quando il coprislip arriva contro lo stadio del microscopio, appiattirà l’orecchio. Fare attenzione a non creare pieghe o creste nell’orecchio. Fissare saldamente il coprislip superiore in modo che mantenga la pressione sufficiente a mantenere l’orecchio piatto. Fare attenzione a non catturare i peli o i baffi del topo nel nastro. A meno che non venga utilizzato un microscopio con una camera ambientale, coprire liberamente il corpo del topo con un drappo sterile per mantenere un ambiente normotermico. Identificare un campo di interesse.Assicuratevi che l’obiettivo si trovi nel punto di riferimento dell’asse z. Utilizzando la luce bianca / imaging a campo ampio, regolare il piano di messa a fuoco nel tessuto dell’orecchio. Una buona strategia è quella di concentrarsi sui vasi sanguigni: se si possono vedere i globuli rossi muoversi nei vasi sanguigni, il piano di messa a fuoco è all’interno del tessuto. Se il microscopio è dotato di capacità di fluorescenza ad ampio campo, utilizzarlo per identificare un campo di interesse. In caso contrario, utilizzare l’imaging confocale. In generale, l’uso della microscopia a campo largo per identificare le aree di interesse è più veloce e richiede meno irradiazione del tessuto auricolare.Utilizzando un cubo filtrante per la rilevazione della proteina fluorescente espressa nel ceppo di riferimento, identificare un campo visivo che ha un segnale fluorescente dal ceppo di riferimento. Tieni presente che la luce fuori fuoco probabilmente impedirà la capacità di concentrarsi sui singoli organismi. L’obiettivo di questo passaggio è identificare un’area di interesse per l’imaging confocale. Passare a un cubo filtrante che rilevi la proteina fluorescente espressa dai ceppi sperimentali e ne verifichi la presenza nel campo visivo selezionato. 6. Imaging Determinare le impostazioni.Mentre il software di imaging è in modalità confocale live, esaminare il campo di interesse mentre il piano focale viene spostato attraverso l’asse z. Scegli un piano dell’asse z con un segnale forte da tutte le proteine fluorescenti utilizzate. Regolare la potenza del laser e/o la velocità di imaging per ottenere un segnale abbastanza forte in modo tale che la morfologia possa essere determinata per tutte le celle nel campo visivo. Per evitare danni ai tessuti, utilizzare la potenza laser più bassa possibile.NOTA: Come per tutte le immagini, esiste un equilibrio tra potenza del laser, velocità di acquisizione e risoluzione. Identificare le impostazioni che identificano chiaramente la morfologia dell’organismo bilanciando velocità e potenza del laser per ridurre al minimo l’irradiazione del tessuto auricolare. Poiché l’imaging avviene attraverso il derma esterno, è necessaria una potenza laser più elevata per l’eccitazione rispetto a quella tipicamente necessaria per l’imaging confocale di campioni tradizionali montati su vetrini. Fortunatamente, il livello di risoluzione spaziale richiesto per l’analisi della morfologia non è estremo. Pertanto, ottenere immagini con un segnale sufficiente per determinare la morfologia dell’organismo senza causare danni ai tessuti è facilmente raggiungibile. Una volta stabiliti questi parametri, utilizzarli durante la sessione di imaging come punto di partenza per le sessioni di imaging successive. È quindi utile salvare le impostazioni di imaging.NOTA: Le singole aree di infezione possono essere meno profonde o più profonde all’interno del tessuto. Le aree più profonde possono richiedere un aumento della potenza del laser. Poiché questo test si basa sulla distribuzione spaziale del segnale piuttosto che sulla sua intensità, è accettabile modificare le impostazioni dell’immagine tra i campi in base alle esigenze. Ottenere le immagini.Scegli un campo visivo che abbia una chiara formazione di filamenti nel ceppo di riferimento e in cui la maggior parte degli organismi sia distribuita abbastanza da poter determinare la loro morfologia. Impostate i piani superiore e inferiore di messa a fuoco per uno stack z. Non è necessario coprire l’intera profondità dell’area infetta, ma tenere presente che gli organismi nella parte superiore o inferiore del volume ripreso sono in genere esclusi dall’analisi. Acquisisci immagini z-stack, pseudocolora ogni canale per distinguere ogni ceppo e sovrapponi i canali. Salvare le immagini. Ripetere l’operazione per gli altri campi visivi. La morfogenesi può variare da luogo a luogo; Pertanto, acquisire e analizzare almeno tre campi da ciascun orecchio è importante. 7. Analisi bidimensionale manuale: frequenza della filamento Utilizzare il software di imaging per eseguire una proiezione massima dello z-stack in un’immagine bidimensionale. Le istruzioni fornite qui sono per FIJI/Image J.Aprire immagini al microscopio utilizzando il software ImageJ. Se necessario, applicare uno pseudo-colore a ciascun canale per consentire una semplice identificazione di ciascun ceppo di C. albicans. Per questo, fai clic su Immagine > Tabella di ricerca > Colore LUT e seleziona lo pseudo-colore scelto. Convertire il file stack in un’immagine bidimensionale di proiezione di massima intensità:Selezionare il file z-stack. Clicca su Immagine > pile > proiezione Z. Selezionate il piano superiore e inferiore e selezionate il tipo di proiezione Intensità massima. Contare ogni organismo visto nelle immagini di proiezione massima per tipo di ceppo (distinto dal colore del canale) e morfologia.Gli organismi che si sovrappongono significativamente o le aree con densità di organismi molto elevata saranno difficili da contare con precisione. Escludeteli dal conteggio, ma fate attenzione a non introdurre pregiudizi contro le forme filamentose, che hanno maggiori probabilità di sovrapporsi. Le forme filamentose che si proiettano direttamente dentro o fuori dallo z-stack appariranno come piccoli oggetti rotondi in una proiezione massima. Allo stesso modo, gli organismi che sono tagliati fuori dal bordo dell’immagine possono sembrare lievito perché il filamento è fuori dal campo visivo. Pertanto, l’analisi bidimensionale sovrastima sempre la percentuale di forme di lievito. Poiché ciò si verificherà allo stesso modo con i ceppi di riferimento e sperimentali, confrontare sempre i risultati sperimentali con quelli di un ceppo di riferimento. Eseguire confronti statistici dei risultati come dettato dal disegno sperimentale. 8. Analisi bidimensionale manuale: lunghezza del filamento Per C. albicans, la formazione di filamenti aberranti può verificarsi perché: a) meno cellule di lievito “madri” subiscono morfogenesi, b) i filamenti crescono a un ritmo più lento, o c) la crescita filamentosa è iniziata ma non mantenuta. Per valutare queste possibilità, quantificare la lunghezza del percorso della curva di ciascun filamento nell’immagine di proiezione massima come surrogato della vera lunghezza tridimensionale (discussa di seguito).Quando una gemma si sta sviluppando su una cellula madre, non è possibile dire se diventerà un filamento o un lievito. Per garantire che solo le cellule filamentose siano incluse in questa analisi, misurare solo gli organismi in cui la cellula figlia è almeno il doppio della lunghezza della cellula madre. Aprire l’immagine di proiezione massima creata nel passaggio 7. Nel set di strumenti ImageJ, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Linea diritta/segmentata e scegliere l’opzione Linea segmentata. L’opzione della linea segmentata consente all’utente di misurare la lunghezza del filamento lungo un percorso curvo, una necessità data la plasticità dei filamenti di C. albicans. Misurare la lunghezza del filamento dal collo del germoglio all’estremità crescente del filamento. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul collo del bocciolo; Il puntatore cambierà in un piccolo quadrato. Traccia il filamento lungo la sua lunghezza, facendo clic sul centro del filamento ogni volta che c’è una curva, una svolta o un cambiamento dell’asse lungo del filamento. Fare doppio clic sulla punta crescente del filamento. Premere Ctrl + M. Si aprirà una finestra pop-up che tabula le misure Area, Media, Min, Max e Lunghezza. Dopo aver misurato ciascun filamento, premere nuovamente CTRL + M per aggiungere la misurazione corrente alla tabella delle misurazioni. Quando tutti i filamenti sono stati misurati, copiare e incollare le misurazioni della lunghezza in un file di analisi dei dati. Eseguire analisi statistiche per valutare la distribuzione delle lunghezze del filamento nel ceppo di riferimento e nel ceppo mutante. 9. Analisi tridimensionale manuale Per ottenere una misurazione più precisa della morfogenesi che eviti la sovrastima delle forme di lievito e possa consentire la discriminazione tra pseudoife e ife, scorrere manualmente su e giù attraverso lo z-stack mentre si valuta la morfologia di ciascun organismo in tre dimensioni. In alternativa, crea un’immagine tridimensionale di ogni z-stack e analizza la forma di ciascun organismo mentre ruota l’immagine. 10. Analisi automatizzata Utilizzando il software di imaging, automatizza l’enumerazione degli organismi e la loro morfologia in due o tre dimensioni.NOTA: alcuni algoritmi per la discriminazione dei tipi morfologici possono introdurre distorsioni. Pertanto, le strategie di automazione devono essere attentamente convalidate in relazione al design sperimentale. Un’analisi automatizzata delle immagini ben progettata e convalidata può aumentare la produttività della fase di analisi.