Avaliação da Transcitose Intestinal de Isolados de Bacteremia de Escherichia coli Neonatal

Escherichia coli é a causa mais comum de sepse de início precoce em recém-nascidos ^1,2,3. A taxa de mortalidade da bacteremia neonatal por E. coli pode chegar a 40%, sendo a meningite uma possível complicação associada a graves incapacidades de neurodesenvolvimento². A ingestão de cepas maternas de E. coli pelo recém-nascido pode produzir bacteremia neonatal; esse processo tem sido replicado em modelos animais ^2,4. Uma vez ingeridas, as bactérias patogênicas viajam do lúmen intestinal neonatal através da barreira intestinal e entram na corrente sanguínea, causando septicemia. Cepas neonatais invasivas de E. coli que produzem bacteremia variam em sua capacidade de invadir células epiteliais intestinais ^1,5. No entanto, sua capacidade de transcitar o epitélio intestinal após a invasão não foi completamente caracterizada.

Este modelo de transcitose intestinal é um método in vitro útil para emular a passagem bacteriana através do epitélio intestinal. O objetivo geral dos métodos apresentados neste manuscrito é comparar a capacidade de isolados neonatais de E. coli de transcitose o epitélio intestinal. O modelo aqui descrito utiliza células T84, que são células imortalizadas de adenocarcinoma intestinal humano ^6,7. As células T84 são cultivadas até a confluência em uma membrana semipermeável com dois compartimentos separados. A justificativa para o uso dessa técnica é que, como acontece in vivo, essas células intestinais polarizam e desenvolvem junções apertadas maduras ^6,8. O lado em contato com a membrana torna-se o lado basal. O lado oposto das células torna-se o lado apical, assemelhando-se ao lúmen intestinal, onde os patógenos ingeridos aderem e invadem. A membrana transwell é permeável a bactérias, mas as células intestinais polarizadas formam junções apertadas, o que prejudica o movimento paracelular bacteriano⁹. Assim, este método proporciona a vantagem de um ambiente controlado in vitro utilizando uma linhagem celular humana para estudar o processo de transcitose bacteriana, incluindo a via transcelular. Enquanto outros métodos existem para investigar a transcitose de bactérias através do epitélio intestinal, o método transwell apresentado aqui fornece maior facilidade e acessibilidade. Técnicas alternativas, como as que utilizam amostras ex vivo configuradas em sistemas de câmara Ussing, estão disponíveis. No entanto, utilizam espécimes de tecido que podem não ser facilmente acessíveis, principalmente se a pesquisa pretende estudar a fisiologia humana¹⁰. Os organoides intestinais representam outro exemplo de alternativa in vitro para o estudo das interações hospedeiro-bactéria¹¹. Embora as monocamadas organoides também possam ser usadas no sistema transwell para estudar a transcitose bacteriana, elas requerem o isolamento e o crescimento de células-tronco e o uso de fatores de crescimento específicos para induzir a diferenciação¹². Assim, seu uso é mais demorado e associado a maiores custos em comparação com o método transwell descrito neste manuscrito.

A avaliação da passagem bacteriana através do epitélio intestinal usando este sistema de transwell in vitro tem sido realizada com sucesso para vários patógenos. Esses estudos têm demonstrado a utilidade do sistema transwell utilizando células T84 para caracterizar a transcitose de bactérias através do epitélio intestinal polarizado^13,14,15. No entanto, a aplicação deste método transwell para comparar a capacidade de transcitose de cepas neonatais de E. coli produtoras de bacteremia não foi descrita em detalhes. Este manuscrito fornece a outros pesquisadores um protocolo de transwell padrão que é confiável e fácil de usar e não requer recursos que são muito caros.

Para comparar a capacidade de cepas neonatais invasivas de E. coli de transcitar o epitélio intestinal, o lado apical da monocamada epitelial intestinal pode ser infectado com um número conhecido de células bacterianas. Após a incubação, o meio no lado basal do epitélio pode ser coletado e as bactérias quantificadas para determinar a quantidade de transcitose bacteriana ao longo do tempo. Neste manuscrito, os métodos apresentados são utilizados para estudar a capacidade de transcitose de cepas clínicas neonatais de E. coli recuperadas de recém-nascidos hospitalizados com bacteremia. Os critérios de inclusão para a seleção desses isolados clínicos neonatais para estudos de transcitose já foram publicados anteriormente ^1,2,16. Quando este método é realizado usando diferentes cepas de E. coli, suas habilidades de transcitose podem ser comparadas. Através deste processo, o modelo de transcitose intestinal fornece dados valiosos para caracterizar os fatores de virulência de E. coli que contribuem para o processo multipasso que culmina no desenvolvimento da bacteremia neonatal.