Оценка кишечного трансцитоза изолятов бактериемии новорожденных Escherichia coli
Summary
Кишечная палочка вызывает сепсис у новорожденных, которые глотают бактерии во время рождения. Процесс, связанный со способностью кишечной палочки перемещаться из кишечнорастворимого тракта в кровоток, плохо изучен. Эта модель in vitro оценивает способность штаммов E. coli путешествовать через эпителиальные клетки кишечника.
Abstract
Новорожденные глотают материнские штаммы E. coli , которые колонизируют их кишечный тракт во время родов. Штаммы E. coli со способностью перемещаться по кишечнику вторгаются в кровоток новорожденного, вызывая опасную для жизни бактериемию. Методология, представленная здесь, использует поляризованные эпителиальные клетки кишечника, выращенные на полупроницаемых вставках, для оценки трансцитоза изолятов бактериемии E. coli новорожденных in vitro. Этот метод использует установленную линию клеток кишечника T84, которая обладает способностью расти до слияния и образовывать плотные соединения и десмосомы. После достижения слияния зрелые монослои T84 развивают трансэпителиальное сопротивление (TEER), которое можно количественно оценить с помощью вольтметра. Значения TEER обратно коррелируют с параклеточной проницаемостью внеклеточных компонентов, включая бактерии, через монослой кишечника. Трансклеточный проход бактерий (трансцитоз), с другой стороны, не обязательно изменяет измерения TEER. В этой модели прохождение бактерий через кишечный монослой количественно оценивается на срок до 6 ч после заражения, и повторные измерения TEER производятся для мониторинга параклеточной проницаемости. Кроме того, этот метод облегчает использование таких методов, как иммуноокрашивание, для изучения структурных изменений в плотных соединениях и других белках клеточной адгезии во время бактериального трансцитоза через поляризованный эпителий. Использование этой модели способствует характеристике механизмов, с помощью которых неонатальная трансцитоза E. coli через эпителий кишечника вызывает бактериемию.
Introduction
Кишечная палочка является наиболее распространенной причиной раннего сепсиса у новорожденных 1,2,3. Смертность от неонатальной бактериемии E. coli может достигать 40%, а менингит является возможным осложнением, которое связано с тяжелыми нарушениями развития нервнойсистемы2. Прием внутрь материнских штаммов кишечной палочки новорожденным может привести к неонатальной бактериемии; этот процесс был воспроизведен на животных моделях 2,4. После попадания в организм патогенные бактерии перемещаются из просвета кишечника новорожденных через кишечный барьер и попадают в кровоток, вызывая септицемию. Неонатальные инвазивные штаммы E. coli, которые продуцируют бактериемию, различаются по своей способности вторгаться в эпителиальные клетки кишечника 1,5. Однако их способность трансцитозировать эпителий кишечника после инвазии не была полностью охарактеризована.
Эта модель кишечного трансцитоза является полезным методом in vitro для эмуляции прохождения бактерий через эпителий кишечника. Общей целью методов, представленных в этой рукописи, является сравнение способности неонатальных изолятов E. coli трансцитозировать эпителий кишечника. Модель, описанная здесь, использует клетки T84, которые являются увековеченными клетками аденокарциномы кишечника человека 6,7. Клетки Т84 выращивают до слияния на полупроницаемой мембране с двумя отдельными отсеками. Обоснование использования этой техники заключается в том, что, как это происходит in vivo, эти клетки кишечника поляризуются и развивают зрелые плотные соединения 6,8. Сторона, соприкасающаяся с мембраной, становится базальной. Противоположная сторона клеток становится апикальной стороной, напоминающей просвет кишечника, куда прилипают и вторгаются проглоченные патогены. Трансвелловая мембрана проницаема для бактерий, но поляризованные клетки кишечника образуют плотные соединения, которые ухудшают движение бактерий параклеток9. Таким образом, этот метод обеспечивает преимущество контролируемой среды in vitro с использованием клеточной линии человека для изучения процесса бактериального трансцитоза, включая трансклеточный путь. В то время как существуют другие методы исследования трансцитоза бактерий через эпителий кишечника, метод трансвелла, представленный здесь, обеспечивает большую легкость и доступность. Доступны альтернативные методы, такие как использование образцов ex vivo, установленных в системах камер Ussing. Тем не менее, они используют образцы тканей, которые могут быть недоступны, особенно если исследование направлено на изучение физиологии человека10. Кишечные органоиды представляют собой еще один пример альтернативы in vitro для изучения взаимодействия хозяина и бактерии11. В то время как органоидные монослои также могут быть использованы в системе трансвелл для изучения бактериального трансцитоза, они требуют выделения и роста стволовых клеток и использования специфических факторов роста для индуцирования дифференцировки12. Таким образом, их использование является более трудоемким и сопряжено с большими затратами по сравнению с методом трансвелла, описанным в данной рукописи.
Оценка прохождения бактерий через эпителий кишечника с использованием этой системы трансвелл in vitro была успешно выполнена для различных патогенов. Эти исследования показали полезность трансвелл-системы с использованием клеток Т84 для характеристики трансцитоза бактерий через поляризованный эпителий кишечника 13,14,15. Однако применение этого трансвелл-метода для сравнения трансцитозной способности неонатальных штаммов E. coli, продуцирующих бактериемию, подробно не описано. Эта рукопись предоставляет другим исследователям стандартный протокол трансвелла, который является надежным и простым в использовании и не требует слишком дорогих ресурсов.
Чтобы сравнить способность неонатальных инвазивных штаммов E. coli трансцитозировать эпителий кишечника, апикальная сторона монослоя эпителия кишечника может быть инфицирована известным количеством бактериальных клеток. После инкубации среда на базальной стороне эпителия может быть собрана, а бактерии количественно определены для определения количества бактериального трансцитоза с течением времени. В этой рукописи представленные методы используются для изучения трансцитозной способности неонатальных клинических штаммов E. coli, полученных от новорожденных, госпитализированных с бактериемией. Критерии включения для отбора этих неонатальных клинических изолятов для исследований трансцитоза были опубликованы ранее 1,2,16. Когда этот метод выполняется с использованием различных штаммов кишечной палочки, можно сравнить их трансцитозные способности. Благодаря этому процессу модель кишечного трансцитоза предоставляет ценные данные для характеристики факторов вирулентности E. coli, которые способствуют многоступенчатому процессу, который завершается развитием неонатальной бактериемии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод получен из методов, используемых в гастроэнтерологии и инфекционных заболеваниях20. Модели in vitro кишечного эпителиального барьера были использованы для выяснения механизмов, с помощью которых просветное содержимое взаимодействует с этим соответствующим к…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана студенческим грантом Сары Моррисон, выданным Медицинской школой Университета Миссури-Канзас-Сити для ИИ.
Materials
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
Referências
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6′-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
