Kwantificering van immunostained Caspase-9 in retinaal weefsel

De caspasen zijn een familie van proteasen die ontwikkelingsceldood, immuunresponsen en afwijkende celdood bij ziekte ^1,2 reguleren. Hoewel het bekend is dat leden van de caspase-familie worden geïnduceerd in een verscheidenheid aan neurodegeneratieve ziekten, is het moeilijker om te begrijpen welke caspase de ziektepathologie aandrijft³. Dergelijke studies vereisen hulpmiddelen om de functie van individuele caspase-familieleden te identificeren, te karakteriseren en te valideren. Het ontleden van de relevante individuele caspasen is belangrijk, zowel vanuit een mechanistisch als een therapeutisch standpunt, omdat de literatuur meerdere studies bevat die bewijs leveren voor de verschillende rollen van caspasen ^4,5. Dus als het doel is om een caspase in een ziekte te richten voor een therapeutisch voordeel, is het van cruciaal belang om specifieke targeting van het relevante familielid (en) te hebben. Traditionele technieken om caspaseniveaus in weefsel te detecteren omvatten western blotting en enzymatische en fluorometrische benaderingen ^3,6. Geen van deze maatregelen maakt echter celspecifieke detectie van caspaseniveaus mogelijk en in sommige scenario’s kunnen gesplitste caspasen vaak niet worden gedetecteerd door traditionele eiwitanalysemaatregelen. Het is bekend dat caspasen verschillende apoptotische en niet-apoptotische rollen kunnen spelen in hetzelfde weefsel⁷, daarom is een zorgvuldige karakterisering van celspecifieke caspaseniveaus nodig voor een nauwkeurig begrip van ontwikkelings- en ziekteroutes.

Deze studie toont caspase activatie en functie in een model van neurovasculaire hypoxie-ischemie – retinale ader occlusie (RVO)^7,8. In een complex weefsel zoals het netvlies zijn er meerdere celtypen die kunnen worden beïnvloed door de hypoxie-ischemie geïnduceerd in RVO, waaronder gliacellen, neuronen en vasculatuur⁷. In het netvlies van de volwassen muis is er zeer weinig expressie van caspasen zichtbaar in gezond weefsel, zoals gemeten door immunohistochemie (IHC)⁷, maar dat is niet het geval tijdens ontwikkeling⁹ of in modellen van retinale ziekte^10,11. IHC is een techniek die goed is ingeburgerd in biomedisch onderzoek en heeft validatie van ziekte en pathologische doelen, identificatie van nieuwe rollen door ruimtelijke lokalisatie en kwantificering van eiwitten mogelijk gemaakt. In gevallen waarin gesplitste caspaseproducten niet kunnen worden gedetecteerd door western blot of fluorometrische analyse, noch de specifieke cellocatie van verschillende caspasen of ondervraging van caspase-signaleringsroutes door lokalisatie, moet IHC worden gebruikt.

Om de caspase(s) functioneel relevant in RVO te bepalen, werd IHC gebruikt met gevalideerde antilichamen voor caspasen en cellulaire markers. De eerdere studies uitgevoerd in het laboratorium toonden aan dat caspase-9 snel werd geactiveerd in een model van ischemische beroerte en remming van caspase-9 met een zeer specifieke remmer beschermd tegen neuronale disfunctie en overlijden¹². Omdat het netvlies deel uitmaakt van het centrale zenuwstelsel (CZS), dient het als een modelsysteem om de rol van caspase-9 bij neurovasculaire verwondingen te onderzoeken en verder te onderzoeken¹³. Hiertoe werd het muismodel van RVO gebruikt om de celspecifieke locatie en distributie van caspase-9 en de implicatie ervan in neurovasculair letsel te bestuderen. RVO is een veel voorkomende oorzaak van blindheid bij werkende volwassenen die het gevolg is van vaatletsel¹⁴. Het bleek dat caspase-9 op een niet-apoptotische manier tot expressie kwam in endotheelcellen, maar niet in neuronen.

Als weefsel heeft het netvlies het voordeel dat het wordt gevisualiseerd als een flatmount, die waardering van de vasculaire netwerken mogelijk maakt, of als doorsneden, die de neuronale retinale lagen benadrukken. Kwantificering van caspase-eiwitexpressie in doorsneden biedt context, met betrekking tot welke caspase potentieel kritisch is in retinale neuronale connectiviteit en visiefunctie door de lokalisatie van de caspase (s) in het netvlies te identificeren. Na identificatie en validatie wordt targeting van de caspase van belang bereikt met behulp van induceerbare celspecifieke deletie van de geïdentificeerde caspase. Voor mogelijke therapeutische onderzoeken werd de relevantie van de caspasen van belang getest met behulp van specifieke hulpmiddelen om de geactiveerde caspase te remmen. Voor caspase-9 werd een celpermeant zeer selectieve remmer ^7,15, Pen1-XBIR3 gebruikt. Voor dit rapport werden 2 maanden oude, mannelijke C57BL/6J stam en tamoxifen-induceerbare endotheel caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stam met een C57BL/6J achtergrond gebruikt. Deze dieren werden blootgesteld aan het muismodel van RVO en C57BL/6J werden behandeld met de caspase-9 selectieve remmer, Pen1-XBir3. De beschreven methodologie kan worden toegepast op andere ziektemodellen in het centrale en perifere systeem ^7,15.