이 프로토콜은 조작 기반 구강 안면 통증 평가 장치를 사용하여 신경 병증 성 구강 안면 통증의 쥐 모델에서 기계적 과민 반응의 평가를 설명합니다.
통증에는 감각적이고 정서적 인 요소가 있습니다. 기존의 반사 기반 통증 분석과 달리 조작적 통증 분석은 설치류 통증의 인지 및 동기 부여 측면을 해결하여 임상적으로 더 관련성 있는 결과를 생성할 수 있습니다. 이 논문은 구강 안면 조작 통증 시스템을 사용하여 쥐에서 안와 신경 (CCI-ION)의 만성 수축 손상 후 기계적 과민증을 평가하기위한 프로토콜을 제시합니다. CCI-ION 수술 전에 쥐는 구강 안면 통증 평가 장치 (OPAD)에서 금속 스파이크 막대 및 릭 튜브와 얼굴 접촉을하면서 가당 연유를 마시도록 훈련 받았습니다.
이 분석에서 쥐는 우유를 양성 강화제로 받거나 보상 접근 구멍의 양쪽에 작은 피라미드 모양의 스파이크가 수직으로 줄지어 생성되는 혐오스러운 기계적 자극을 피할 수 있습니다. OPAD에서 2주간의 훈련 후 CCI-ION 수술 전에 10분 테스트 세션 동안 각 래트에 대해 5일 동안 기준선 기계적 민감도 데이터를 기록했습니다. 세션 중에 조작 시스템은 보상 병 활성화 횟수(핥기) 및 얼굴 접촉, 접촉 시간 및 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간 등을 자동으로 기록합니다.
기준선 측정 후, 쥐는 CCI-ION 또는 가짜 수술을 받았다. 이 프로토콜에서는 핥기 횟수, 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간, 접촉 수 및 얼굴 접촉에 대한 핥기의 비율(L/F)을 측정하여 기계적 과민성을 정량화했습니다. 데이터에 따르면 CCI-ION은 핥기 횟수와 L/F 비율이 크게 감소하고 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간이 증가하여 기계적 과민증을 나타냅니다. 이러한 데이터는 전임상 통증 연구에서 기계적 통증 민감도를 평가하기 위해 조작적 기반 통증 분석의 사용을 지원합니다.
만성 통증은 매년 수백만 명의 미국인에게 영향을 미칩니다1. 불행히도 만성 통증은 기존 치료법이 만성 통증을 완화하는 데 상대적으로 효과적이지 않고 장기간 사용하면 바람직하지 않은 부작용이 발생하기 때문에 치료하기가 어렵습니다 2,3,4. von Frey 분석과 같은 전통적인 전임상 통증 분석은 반사적 결과 또는 통증자극 반응에 의존합니다5. 폰 프레이 분석은 기계적 이질통을 측정하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔지만 몇 가지 교란 요인, 특히 실험자 편향6에 취약합니다. 구강 안면 통증을 평가하기위한 폰 프레이 (von Frey) 검사의 사용은 얼굴 부위를 성공적으로 테스트하기 위해 동물의 머리를 고정하는 데 필요한 구속 정도가 있기 때문에 문제가되며, 이는 통증 강화 또는 반대로 스트레스 유발 진통과 같은 바람직하지 않은 스트레스 효과를 유발할 수 있습니다.
통증 자극 행동은 또한 위양성 결과7에 취약하며 인간의통증 경험8에 필수적인 통증의 정서적 요소를 설명하지 않습니다. 따라서 전임상 테스트에서 내용과 예측 타당성을 개선하기 위해 통증의 감각 및 정서적 구성 요소를 모두 포함하는 통증 우울 행동을 평가하는 조작적 통증 모델을 사용하는 데 관심이 증가하고 있습니다. 여기에 설명된 조작적 구강안면 통증 평가 분석은 보상-충돌 패러다임 9,10,11을 기반으로 합니다. 이 분석에서 설치류는 양성 강화제를 받고 통각 자극을 받거나 보상을 포기하고 통각 자극을 피함으로써 경험하는 통증의 양을 조절할 수 있습니다. 기존의 통증 분석과 달리 조작적 기반 분석은 실험자 독립적이며 바람직하지 않은 진정 효과로 인해 위양성 결과에 취약하지 않습니다.
머리와 얼굴의 유해한 감각은 삼차 신경의 안과, 상악 및 하악 가지에 의해 운반됩니다. 삼차 신경의 손상 또는 염증은 열 또는 기계적 자극12,13,14,15에 대한 감각 뉴런의 민감도를 증가시킵니다. 조작 기반 구강 안면 통증 분석은 설치류 11,12,16,17,18에서 삼차 신경에 의해 전달되는 열 또는 기계적 구강 안면 통증의 자동 측정을 제공합니다. 무해하고 유해한 자극을 사용한 자극은 OPAD를 사용하여 구강 안면 부위의 열 및 기계적 이질통과 통각 과민을 테스트하는 것의 중요한 차이점입니다.
구강 안면 열 분석에서 동물은 보상에 접근하기 위해 부드러운 열화물에 얼굴을 누릅니다. 열화물은 다양한 차갑고 따뜻하며 뜨거운 온도로 설정할 수 있으므로 중성 또는 통각 수용 조건에서 거동을 평가할 수 있습니다. 구강 안면 기계 분석에서 동물은 조작 적 테스트 중에 스파이크 막대에 얼굴을 대고 누릅니다. 이러한 스파이크가 어느 정도의 불편함을 유발하기 때문에 설치류는 얼굴이 스파이크에 닿을 때 보온화물의 매끄러운 표면에 비해 술을 덜 마실 수 있습니다. 따라서, 조작적 구강안면 기계적 분석은 다양한 정도의 기계적 통각자극의 효과를 평가할 수 있다. 우리는 이전에 OPAD가 급성 열9, 급성 기계적19, 통각 및 통각 과민을 평가하는 데 유용하고 신뢰할 수있는 방법임을 입증했습니다.
이 논문은 기계적 통각 및 과민증을 평가하기 위해 새로 개발 된 OPAD 버전의 사용을보고합니다. 또한 검증을 통해 OPAD에서 예측 가능한 반응을 초래하는 만성 신경병증을 유도하는 CCI-ION의 능력을 입증합니다. 또한 OPAD 및 관련 소프트웨어를 사용하여 설치류 행동 데이터를 신속하게 얻고 분석하는 방법도 자세히 설명합니다.
얼굴 및 구강 내 점막의 무해한 기계적 자극에 의해 유발되는 통증은 삼차 신경통 및 측두 하악 관절 장애24,25를 포함한 구강 안면 통증 상태의 두드러진 특징입니다. 삼차 신경 병증 성 통증은 임상 적으로 잘 설명되어 있지만 설치류의 신경 병증 성 통각 수용성 행동의 평가는 어렵습니다. 반사적 행동을 측정하는 통증 분석은 전임상 통증 연구에서 가장 자주 사용되는 방법입니다. 그러나 테스트 장치 관련 스트레스, 정서적 상태를 평가할 수 없음 및 실험자 편향은 반사 분석26의 유용성과 유효성에 대한 우려를 제기합니다.
이 연구는 쥐의 구강 안면 영역에서 기계적 민감도 평가를 소개하여 조작 기반 통증 분석을 사용하여 CCI-ION에 대한 민감성을 입증합니다. 동일한 조작 시스템을 사용하여 마우스의 기계적 감도를 테스트 할 수도 있습니다. 마우스 및 래트 균주는 CCI-ION에 대한 반응에 변화를 나타낼 수 있으며, 따라서 기계적 과민 반응의 수준이 다를 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, Sprague-Dawley 쥐는 일반적으로 CCI-ION 후 2 주에 안정적인 기계적 과민증이 발생하고, CCI-ION 후 4 주 후에 회복되기 시작하며, CCI-ION의 6 주 후에 수술에서 회복되는 것을 봅니다.
이 프로토콜에서는 핥기 횟수와 접촉, L/F 및 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간을 측정하여 기계적 과민증을 정량화했습니다. 데이터는 CCI-ION이 L/F와 핥는 반응의 수를 감소시키고 첫 번째 핥기 반응에 대한 잠복기를 증가시킨다는 것을 보여주었으며, 이는 동물이 구강 안면 통증 민감도 증가로 인해 스파이크 막대에 얼굴을 누르기를 꺼린다는 것을 나타냅니다.
OPAD는 동물이 맛있는 보상에 접근하기 위해 통각 자극을 견뎌야 하는 보상 충돌 분석입니다. 분석에서 핥는 행동은 식욕을 돋우는 행동의 영향을 받을 수 있습니다. 또한이 연구에서는 얼굴 털이있는 쥐를 사용했습니다. 조작적 통증 분석에 대한 이전 경험에 기초하여, 설치류 중에서 무모 균주가 안면 접촉을 감지하는 데 더 좋습니다16; 그러나 출판 당시에는 털이 없는 쥐 균주가 더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않았습니다. 이것은 연구의 한계로 간주 될 수 있습니다. 우리는 또한 암컷 Sprague-Dawley 쥐 만 사용했기 때문에 통증 반응의 성별 및 긴장 관련 차이를 예상해야합니다.
또한 분석을 통해 최적의 결과를 보장하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 정확한 핥기 및 접촉 데이터는 참조된 소프트웨어에서 각각 빨간색과 흰색 블록으로 나타나야 합니다( 그림 3 참조). 스파이크와 우유병 사이의 거리는 실험의 성공에 매우 중요합니다. 우유병의 끝이 너무 앞으로 가면 동물이 스파이크와 접촉하지 않고 소프트웨어가 연락처를 올바르게 등록하거나 번호를 핥지 않습니다. 반대로, 우유 병이 너무 멀리 떨어져 있으면 연락처가 등록되지만 동물은 우유에 도달 할 수 없습니다. 훈련 세션 중에 핥기 데이터는 우유병 끝이 너무 앞쪽에 있기 때문에 단색 흰색 블록으로 나타날 수 있습니다. 우유병을 뒤로 밀면 빨간색 고체 블록으로 바뀝니다. 어떤 이유로 핥기 데이터가 표시된 거리에서 흰색 블록으로 나타나기 시작하면 병을 약간 밀고 우유 홀더를 약간 아래쪽/위쪽으로 움직이면 도움이 될 수 있습니다.
여기에 설명된 구강안면 조작성 통증 시스템의 한계로 몇 가지 점을 고려할 수도 있습니다. 설치류의 훈련이 필요하며 몇 주가 걸립니다. 각 테스트 세션 전에 쥐에서는 음식 제한이 필요하지만 쥐에서는 필요하지 않습니다. 단식되지 않은 마우스는 금식 마우스에 비해 핥는 횟수가 낮고 일관되지 않은 것으로 나타났습니다27. OPAD 시스템은 보상 충돌 모델이기 때문에 동물의 식욕 행동이나 식욕에 영향을 미치는 약물의 영향을받을 수 있습니다. 다중 장치를 갖는 것은 또한 동물을 시험하는 전체 시간을 단축시키는데 유리하며, 이는 비용을 증가시킬 수 있다. 그러나 구강 안면 조작 통증 분석은 동시에 여러 동물을 테스트 할 수 있고 동물 실험자 상호 작용을 제한하기 때문에 기존의 반사 기반 분석보다 여전히 유리합니다.
통증 상태 동안의 조작적 조건화는 결과에 따라 인간과 동물의 행동을 수정합니다28. 따라서 보상-충돌 모델을 사용하면 동물이 조작적 반응을 수행할 수 있기 때문에 통증 상태를 평가하는 데 유리합니다. 이것은 조작적 행동의 특성이 의도, 동기 부여 및 일반적으로 피질 처리29를 포함하기 때문에 임상적으로 더 관련이 있습니다. 동물이 자발적으로 보상 병에 접근하고 언제든지 스파이크 막대에서 자유롭게 철수 할 수 있기 때문에 뇌의 더 높은 중심을 통합하고 통증10과 관련된 정서적 동기 부여 상태를 평가할 수 있습니다. 따라서 조작적 통증 분석은 생체 내에서 통증 및 진통제를 평가할 때 우수한 데이터를 제공합니다. 그들은 또한 삼차 시스템의 통각 과정을 이해하는 데 도움을 주어 구강 안면 통증 분야의 발전에 기여합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 안면 통증 연구 재단 (Facial Pain Research Foundation)의 자금 지원을 받고 있습니다.
ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
Dish sponge | ANY | ANY | |
GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
Oxygen tank | Medical | ||
Paper towel | ANY | ANY | |
Plastic food wrap | ANY | ANY | |
Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
Spoon | ANY | ANY | |
Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |