Отделение субпопуляций иммунных клеток в образцах периферической крови у детей с инфекционным мононуклеозом
Summary
Описан метод, сочетающий иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток мононуклеарных клеток периферической крови (моноцитов, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и естественных клеток-киллеров). С помощью этого метода магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены и проанализированы.
Abstract
Инфекционный мононуклеоз (IM) является острым синдромом, в основном связанным с первичной инфекцией вируса Эпштейна-Барра (EBV). Основные клинические симптомы включают нерегулярную лихорадку, лимфаденопатию и значительное повышение лимфоцитов в периферической крови. Патогенный механизм ИМ до сих пор неясен; для него не существует эффективного метода лечения, в основном доступна симптоматическая терапия. Основной вопрос в иммунобиологии ВЭБ заключается в том, почему только у небольшой подгруппы инфицированных людей проявляются тяжелые клинические симптомы и даже развиваются злокачественные новообразования, связанные с ВЭБ, в то время как большинство людей бессимптомны на всю жизнь с вирусом.
В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Естественные клетки-киллеры (NK) являются цитотоксическими врожденными лимфоцитами, которые важны для уничтожения клеток, инфицированных EBV. Доля CD4 + Т-клеток уменьшается, в то время как доля CD8 + Т-клеток резко расширяется во время острой инфекции EBV, и персистенция CD8 + Т-клеток важна для пожизненного контроля IM. Эти иммунные клетки играют важную роль в IM, и их функции должны быть идентифицированы отдельно. Для этого моноциты отделяют сначала от мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) им-особей с помощью микрошариков CD14, колонки и магнитного сепаратора.
Остальные PBMCs окрашивают перидинин-хлорофилл-белком (PerCP)/цианином 5.5 анти-CD3, аллофикоцианином (APC)/цианином 7 анти-CD4, фикоэритрином (PE) анти-CD8, флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) анти-CD19, APC анти-CD56 и APC анти-CD16 антителами для сортировки CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и NK-клеток с использованием проточного цитометра. Кроме того, было проведено секвенирование транскриптома пяти субпопуляций для изучения их функций и патогенных механизмов в IM.
Introduction
Вирус Эпштейна-Барра (EBV), γ-герпесвирус, также известный как вирус герпеса человека типа 4, повсеместно распространен в человеческой популяции и устанавливает пожизненную латентную инфекцию у более чем 90% взрослого населения1. Большинство первичных инфекций ВЭБ происходит в детском и подростковом возрасте, причем у части пациентов проявляется инфекционный мононуклеоз (IM)2, демонстрируя характерную иммунопатологию, включая активированный иммунный ответ с CD8 + Т-клетками в крови и преходящую пролиферацию инфицированных ВЭБ В клеток в ротоглотке3. Курс ВМ может длиться 2–6 недель и большинство пациентов хорошо выздоравливают4. Тем не менее, у некоторых людей развиваются стойкие или рецидивирующие IM-подобные симптомы с высокой заболеваемостью и смертностью, которые классифицируются как хроническая активная инфекция ВЭБ (CAEBV)5. Кроме того, ВЭБ является важным онкогенным вирусом, который тесно связан с различными злокачественными новообразованиями, включая эпителиоидные и лимфоидные злокачественные новообразования, такие как аназофарингеальная карцинома, лимфома Беркитта, лимфома Ходжкина (HL) и Т/NK-клеточная лимфома6. Хотя ВЭБ изучается уже более 50 лет, его патогенез и механизм, с помощью которого он индуцирует пролиферацию лимфоцитов, не были полностью выяснены.
В нескольких исследованиях изучались молекулярные сигнатуры иммунопатологии ВЭБ-инфекции путем секвенирования транскриптома. Zhong et al. проанализировали профилирование цельного транскриптома мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) у китайских детей с IM или CAEBV, чтобы обнаружить, что cd8 + Т-клеточная экспансия была преимущественно обнаружена в группе IM7, предполагая, что CD8 + Т-клетки могут играть важную роль в IM. Аналогичным образом, другое исследование обнаружило более низкие пропорции специфичных для ВЭБ цитотоксических Т- и CD19+ В-клеток и более высокий процент CD8+ Т-клеток у пациентов с ВМ, вызванных первичной инфекцией ВЭБ, чем у пациентов с ВМ, вызванной как реактивацией ВЭБ, так и другими агентами8. В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Al Tabaa et al. обнаружили, что В-клетки были поликлонально активированными и дифференцированными интоплазмабластами (CD19+, CD27+ и CD20− и CD138− клетками) и плазматическими клетками (CD19+, CD27+ и CD20− и CD138+) во время IM9. Кроме того, Zhong et al. обнаружили, что моноцитарные маркеры CD14 и CD64 были повышены в CAEBV, предполагая, что моноциты могут играть важную роль в клеточном иммунном ответе CAEBV через антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и гиперактивный фагоцитоз7. Alka et al. охарактеризовали транскриптом MACS,отсортированных CD56dim CD16 + NK-клеток от четырех пациентов IM или HL и обнаружили, что NK-клетки как из IM, так и из HL имели сниженный врожденный иммунитет и сигнальные гены хемокина, которые могут быть ответственны за гипочувствительность NK-клеток10. Кроме того, Greenough et al. проанализировали экспрессию генов отсортированных CD8+ Т-клеток из 10 PBMCs людей с IM. Они сообщили, что большая часть CD8+ Т-клеток в IM была вирус-специфичной, активированной, делящейся и праймированной для оказания эффекторной активности11. Как Т-клеточно-опосредованные, специфические для ВЭБ ответы, так и NK-клеточные, неспецифические ответы играют важную роль во время первичной инфекции ВЭБ. Однако в этих исследованиях изучались только результаты транскриптома разнообразной смеси иммунных клеток или только определенной субпопуляции лимфоцитов, чего недостаточно для всестороннего сравнения молекулярных характеристик и функций различных субпопуляций иммунных клеток у детей с ВМ в одном и том же болезненном состоянии.
В данной статье описывается метод, который сочетает в себе иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS) для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток PBMCs (моноциты, CD4 + Т-клетки, CD8 + Т-клетки , В-клетки и NK-клетки). Используя этот метод, магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены с помощью магнитного сепаратора и FACS или проанализированы с помощью проточной цитометрии. РНК может быть извлечена из очищенных клеток для секвенирования транскриптома. Этот метод позволит характеризовать и экспрессию генов различных иммунных клеток в одних и тех же состояниях заболевания людей с IM, что расширит наше понимание иммунопатологии инфекции EBV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой эффективный способ сортировки субпопуляций иммунных клеток периферической крови. В этом исследовании образцы венозной крови пациентов с ВМ, здоровых носителей ВЭБ и детей, не инфицированных ВЭБ, были выбраны в качестве цели исследования. Эта работа с ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82002130), Пекинским фондом естественных наук (7222059) и Инновационным фондом медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-026).
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Referências
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
