JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Utvärdering och manipulation av neural aktivitet med hjälp av tvåfotonholografisk mikroskopi

Published: September 16, 2022
doi:
10.3791/64205
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Molecular Cell Biology,Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Division of Multicellular Circuit Dynamics, National Institute for Physiological Sciences,National Institutes of Natural Sciences, 3Department of System Science,Kobe University Graduate School of System Informatics, 4Department of Biology, Graduate School of Sciences,Kobe University, 5Department of Information Science,Kobe University Graduate School of System Informatics, 6Center of Optical Scattering Image Science,Kobe University

Summary

Vi utvecklade ett tvåfotonholografiskt mikroskop som kan visualisera, bedöma och manipulera neural aktivitet med hög spatiotemporal upplösning, i syfte att belysa patogenesen av neuropsykiatriska störningar som är förknippade med onormal neural aktivitet.

Abstract

Nya framsteg inom optisk bioimaging och optogenetik har möjliggjort visualisering och manipulation av biologiska fenomen, inklusive cellulära aktiviteter, hos levande djur. Inom neurovetenskap har detaljerad neural aktivitet relaterad till hjärnfunktioner, såsom inlärning och minne, nu avslöjats, och det har blivit möjligt att artificiellt manipulera denna aktivitet för att uttrycka hjärnfunktioner. Den konventionella utvärderingen av neural aktivitet med tvåfotons Ca2+ -avbildning har emellertid problemet med låg tidsupplösning. Dessutom kan manipulation av neural aktivitet genom konventionell optogenetik genom optisk fiber endast samtidigt reglera aktiviteten hos neuroner med samma genetiska bakgrund, vilket gör det svårt att kontrollera aktiviteten hos enskilda neuroner. För att lösa detta problem utvecklade vi nyligen ett mikroskop med hög spatiotemporal upplösning för biologiska tillämpningar genom att kombinera optogenetik med digital holografisk teknik som kan modifiera femtosekund infraröda laserstrålar. Här beskriver vi protokoll för visualisering, utvärdering och manipulation av neural aktivitet, inklusive beredning av prover och drift av ett tvåfotonholografiskt mikroskop (figur 1). Dessa protokoll ger korrekt spatiotemporal information om neural aktivitet, vilket kan vara användbart för att belysa patogenesen av neuropsykiatriska störningar som leder till abnormiteter i neural aktivitet.

Introduction

Tvåfotoner Ca2+ avbildning är en användbar teknik för bedömning av neural aktivitet. Det kan användas för att identifiera inte bara den neurala aktivitet som krävs för beteende och minne hos normala djur1,2 utan också en onormal neuronal aktivitet som förekommer i musmodeller av neuropsykiatriska störningar 3,4. Tekniken har använts för att belysa den neurala grunden för hjärnfunktioner. Men även om den kan ge högupplösta och högkvalitativa bilder är dess tidsupplösning lägre än den elektrofysiologiska metoden 1,3.

Optogenetik har hjälpt till att förnya hur neuroforskare förstår hjärnans funktion5. Med tanke på de tekniska begränsningarna har majoriteten av optogenetisk forskning använt aktiveringsscheman med låg rumslig upplösning, vilket begränsar de typer av manipuleringar av neural aktivitet som kan utföras i enlighet därmed. Att manipulera neural aktivitet på finare spatiotemporala skalor kan dock potentiellt vara användbart för en mer fullständig förståelse av neurala beräkningar och patogenesen av neuropsykiatriska störningar. Rumsligt exakt holografisk teknik som kan forma femtosekund nära infraröda laserstrålar lovar att övervinna denna utmaning och öppnar flera nya experimentella klasser som tidigare var omöjliga 6,7. Denna teknik gör det möjligt för neuroforskare att avslöja de grundläggande aspekterna och patologierna av sensoriska, kognitiva och beteendemässiga neurala koder som har varit utom räckhåll.

Holografisk projektion innebär generering av önskade ljusmönster för att komma åt enskilda celler och funktionella nätverk selektivt. In vivo-experiment kräver optimal ljusöverföring till målceller i den levande hjärnan. Infrarött ljus tränger djupare in i levande vävnad och kan användas för icke-linjär tvåfotonexcitation (2PE)8,9,10. Således kan tvåfotonholografisk mikroskopi, som kombinerar holografisk projektion och 2PE, användas för att utvärdera och manipulera neurala aktiviteter för att undersöka cellulära och funktionella nätverk in vivo. Nya biologiska tillämpningar av tvåfotonholografisk mikroskopi har belyst den neurala aktiviteten och kretsarna som krävs för inlärning i visuell cortex 11,12, luktlampa13 och hippocampus14.

Många laboratorier världen över har rapporterat spännande resultat och förbättringar med hjälp av sina holografiska stimuleringssystem 15,16,17,18,19,20,21,22,23. I det system som beskrivs här kan det holografiska stimuleringssystemet byggas som en tilläggsanordning för ett konventionellt mikroskop. Den fas-bara rumsliga ljusmodulatorn (SLM) är nyckelanordningen för att modulera en plan vågfront till vilken form som helst, och interferenseffekten används för att styra intensiteten och placeringen av foci. Figur 2 visar ljusbanor för holografisk stimulering och avbildning. Den första ljusvägen är för punktskanningsläge och består av ett skanningshuvud och bilddetektorer. Den andra ljusvägen är för holografisk stimulering med en våglängd på 1040 nm och består av en SLM1. Den tredje ljusvägen är för holografisk belysning med 920 nm våglängd och består av en SLM2 och en bildsensor. Det holografiska avbildningsläget kan registrera intensiteter från flera intressanta regioner genom att belysa flera punkter i provet. På detta sätt kan inspelningshastigheten ökas till några hundra bilder per sekund. För att uppnå punktskanning eller holografisk belysningsavbildning delades 920 nm-lasern i två banor med en stråldelare med ett fast förhållande på 3: 7. Alla optiska element var inriktade på en optisk brödbräda med dimensioner på 600 mm × 600 mm. Det modulerade ljuset kom in genom ljusporten på sidan av den mikroskopiska kroppen, medan punktskanningsljuset kom in genom skanningshuvudet högst upp på mikroskopkroppen. Dessa lampor integrerades strax ovanför objektivlinsen och skapade foci i provplanet. Dessutom gjorde den skräddarsydda programvaran det vanliga arbetsflödet enkelt och konsekvent.

I denna artikel presenteras ett komplett protokoll för användning av holografisk stimulering eller belysning för att mäta neural aktivitet och bedöma den funktionella anslutningen mellan neuroner. I demonstrationssyfte beskriver vi här en hjärnkirurgi riktad mot bakbensområdet i den primära somatosensoriska cortexen (S1HL) i mushjärnan och en metod för att bedöma och manipulera neural aktivitet med hjälp av tvåfotonholografisk mikroskopi. Det experimentella förfarandet är uppdelat i fyra delar. Först fixerades huvudplattan på musens skalle med tandcement. För det andra injicerades en viral vektor som uttryckte jGCaMP8f eller GCaMP6m-P2A-ChRmine stereotaktiskt i S1HL. För det tredje kalibrerades det holografiska stimulerings- eller belysningssystemet. För det fjärde, efter postoperativ återhämtning och uttryck av dessa två proteiner, utfördes in vivo Ca2+ -avbildning för att bedöma den neurala aktiviteten och funktionella anslutningen mellan neuroner med tvåfotonholografisk mikroskopi.

Protocol

Alla experimentella protokoll godkändes av djurvårds- och användningskommittéerna vid Nagoya University Graduate School of Medicine (godkännandenummer: M220295-003). 1. Implantation av huvudplatta (figur 1A) Administrera bedövningsmedlet (en blandning av 74 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin) intraperitonealt för att bedöva musen. Kontrollera musens bedövningsstatus ofta genom att bedöma pedalreflexerna. Efter anestesi, placera musen i ett stereotaxiskt instrument. Applicera en ögonsalva (se Materialförteckning) för att förhindra att hornhinnan torkar ut när huvudplattan implanteras. Raka det kirurgiska området och desinficera huden med tre alternerande omgångar povidon-jod eller klorhexidin scrubs följt av 70% alkoholservetter. Exponera försiktigt skallen och rengör den med bomullspinne.OBS: Alla kirurgiska instrument ska steriliseras och alla procedurer ska utföras i enlighet därmed. Eventuellt kvarvarande skräp (t.ex. hår eller torkat blod) orsakar inflammatoriska reaktioner. Därför bör eventuellt skräp avlägsnas under ett stereoskop med bomullspinne fuktad med sterilt vatten eller 70% alkohol. Använd de stereotaktiska koordinaterna – främre och bakre = 0,5 mm, mediala och laterala = 1,5 mm från bregma – för att hitta kraniotomins centrum och märka den med en markörpenna. Placera en skräddarsydd huvudplatta i mitten av skallen. Applicera sedan tandcement (se materialförteckning) för att fixera det ordentligt på skallen. Applicera lätt tryck tills huvudplattan gör fast kontakt med framsidan och baksidan av skallen.OBS: Detta steg tar cirka 20 minuter att slutföra och är avgörande för att minska rörelseartefakter i hjärnan under tvåfotonavbildning. Huvudplattans mått är 20 mm × 40 mm × 1 mm med en hemmaplatta med en kant 15 mm lång, två intilliggande sidor 3 mm långa och de återstående två sidorna 10 mm långa. Blanda ihop ett akrylbaserat tandhäftande hartscement enligt följande: en halv sked pulver, tre droppar vätska och en droppe katalysator (se materialtabell). För att förhindra torkning, applicera detta blandade tandhäftande hartscement på musens intakta skalleyta med huvudplattan. Placera musen i en varm bur tills den har återhämtat sig från anestesi. Lämna inte musen utan uppsikt förrän den har återfått tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande. 2. Kirurgi och adenoassocierat virus (AAV) injektion (figur 1B) Utför kraniotomi eller viral injektion utan att avlägsna tandhäftande hartscement från skallen 1 dag efter implantation av huvudplattan.OBS: Administrera anestesi (en blandning av 74 mg / kg ketamin och 10 mg / kg xylazin) intraperitonealt till musen under denna procedur. För att undvika hjärnödem, administrera dexametasonnatriumfosfat (1,32 mg/kg) intraperitonealt 1 h före operationen. Bedöva musen med huvudplattan med 1% isofluranbedövning med hjälp av en vaporizer (anestesileveranssystem) samtidigt som kroppstemperaturen bibehålls med en värmedyna. Applicera en ögonsalva för att förhindra hornhinnetorkning. Under ett stereoskop, utför en cirkulär kraniotomi ca 2 mm i diameter med hjälp av en tandborr. För att minska hjärnskador, använd tandborren försiktigt med konstant lätt rörelse och lätt nedåtgående tryck. Ta bort benfragment flera gånger med ett sugsystem. Efter avlägsnande av benfragmenten, använd en konstgjord spinalvätska (ACSF) lösning för att ta bort och tvätta eventuellt skräp kvar på hjärnytan. Upprepa denna rengöringsprocedur flera gånger för att undertrycka inflammatoriska reaktioner.OBS: ACSF-lösningen (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2,0 mM CaCl 2 och 1,0 mM MgCl2) förvarades vid 4 ° C i 1 månad efter att reagenset löstes och filtrerades (porstorlek = 0,22 μm). Ställ in lämpligt tryck (ca 10 PSI i pulser med en varaktighet på 4 ms) med hjälp av ett tryckinsprutningssystem (se materialtabell) för att injicera 500 nL AAV-lösning genom en glaskapillär med en spetsdiameter på 10-20 μm (beredd med en mikropipettavdragare) i 10 minuter. Bestäm om AAV-lösningen administreras till hjärnan genom att kontrollera om nivån av AAV-lösningen i glaskapillären gradvis minskar. Låt glaskapillären sitta på plats i ytterligare 10 minuter för att förhindra återflöde. Upprepa tre gånger för att administrera totalt 1,5 μL AAV-lösning i hjärnan. För att utvärdera och manipulera neural aktivitet i pyramidala celler i lager 2/3 (L2/3), injicera en AAV-lösning (för Ca 2+ avbildning: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE vid 1,28 × 1014 vektorgenom/ml, utspädd 1:1 i saltlösning; för Ca2+ avbildning med optogenetik: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE vid 1,73 × 1014 vektorgenom/ml, utspädd 1:1 i saltlösning) i baktassområdet i den primära somatosensoriska cortexen hos vildtypsmöss (S1, centrerad på 0,5 mm bakom och 1,5 mm i sidled från bregma, 150 μm djup från ytan).AAV-lösningen ska injiceras 2-3 veckor och 1-2 veckor före avbildning för jGCaMP8f- respektive GCaMP6m-P2A-ChRmine-uttryck. Efter en applicering av 2% (w / v) lågsmältande agaros på hjärnytan av S1 med hjälp av en mikropipett, placera ett glasfönster över kraniotomin med två täckglas. Fäst de två täckglasen (liten diameter på 2,0 mm och stor diameter på 4,5 mm, se Materialförteckning) med UV-härdbart lim. Tryck täckglaset mot agarosen medan det fortfarande är flytande; Detta förhindrar bildandet av luftbubblor i agarosen. Försegla kanterna på kranialfönstret med tand- och limhartscement (figur 1C). Ta bort musen från det stereotaxiska instrumentet och sätt tillbaka den i buret. Placera musen i en varm bur och återvänd inte till buret med andra djur förrän den har återhämtat sig helt från anestesi. Behåll försiktigt sterila förhållanden under överlevnadsoperationen. För de första 72 h efter operationen, kontrollera musens hälsotillstånd genom att observera allmänt beteende. Om det finns några abnormiteter i allmänt beteende, injicera subkutant antiinflammatoriska och smärtstillande medel. 3. Förberedelse för det holografiska stimulerings- eller belysningssystemet (figur 3) Kalibrera det holografiska stimuleringssystemet genom att placera ytan på ett rött fluorescensglas (gjutet akrylsubstrat) vid provplanet. Placera mikroskopet i live-bildläge med ett svagt excitationsljus och kör calibration_GUI.m-fil. Kontrollera parameterfönstret och klicka på knappen Spara . Klicka på Z Scan knappen i steg 1 rutan. Det genererar automatiskt tre slumpmässiga fläckar i alla 21 axiella plan, 2 μm från varje plan. Flytta skjutreglaget och kontrollera livebilden. Hitta ett perfekt plan där fläckarna verkar vara de minsta och ljusaste och klicka sedan på Save knapp. Detta genererar automatiskt en förskjuten sfärisk vågfront för det digitala hologrammet.OBS: Om du inte hittar de ljusaste fluorescensfläckarna, ändra minimi- och maximivärdena för skanningsområdet och försök igen. Klicka på knappen Gå i fönstret Steg 2 och klicka sedan på sex platser i den vänstra rutan. Kontrollera livebilden. Om det finns sex urskiljbara fluorescenspunkter skriver du deras x- och y-axel i redigeringsrutorna och klickar på knappen Spara . Detta genererar automatiskt affintransformkoefficienter för att koordinera kalibrering mellan det holografiska stimulerings- och bildsystemet.OBS: Axelparnumret och klickat dekornummer måste matchas i ordning. Om du är osäker, eller om det inte finns några fläckar i bilden, försök igen och skapa ett unikt dekorfärgsmönster eller välj ett mindre intervall runt mitten av synfältet (FOV). Klicka på knappen Skanna i fönstret Steg 3. Det kommer att generera 441 digitala hologram för att utföra skanning med en enda fläck över synfältet i 21 × 21 steg.Kontrollera först bilderna medan du ändrar mönster i listrutan. Justera sedan lasereffekten för att få dekorbilder inom bildåtergivningsenhetens dynamiska område (till exempel för att undvika alltför mättade bilder). Justera sedan intervalltiden i redigeringsrutan; Intervalltiden bör vara mer än två gånger inspelningsintervalltiden. Slutligen sätta bildenheten i inspelningsläge och klicka på Spela knapp. Om uppspelningen är klar visas “visa OK” -strängar i kommandofönstret. Stoppa inspelningen och stapla upp inspelade sekventiella bilder med maxintensitetsmetoden. Klicka på Generera WM i steg 4-fönstret och välj en staplad bild ovan. Stäng sedan calibration_GUI-fönstret. Det genererar automatiskt en viktkarta för att kompensera för den obalanserade intensiteten på varje plats.OBS: För en mer detaljerad beskrivning, se 2; Matlab-koden kan laddas ner härifrån (https://github.com/ZenKG/SLM_control). 4. Ca2+ avbildning med en bildsensor med holografisk belysning (figur 4) Placera den AAV-injicerade musen med en huvudplatta under mikroskopet (figur 1D).Under denna procedur är musen fasthållen i vaket tillstånd, men kan undkomma obehagliga stimuli. Utför tvåfotonavbildning (punktskanningsläge) med hjälp av ett holografiskt mikroskop och en lägeslåst Ti:safirlaser inställd på 920 nm med ett 25x objektiv (se materialförteckning). Slå på programvaran för kommersiell bildbehandling (se Materialförteckning). I livebildsläget justerar du bilddetektorns spänning (se Materialtabell) och bildlaserns effekt för att optimera ljusstyrkan hos neuronerna som uttrycker jGCaMP8f. Ta bilder av neuronerna som uttrycker detta protein.OBS: Bildlaserns intensitet (920 nm) är 20-30 mW. Synfältet var 512 μm × 512 μm på ett djup av 100-150 μm från den kortikala ytan. Om du vill belysa specifika neuroner som uttrycker jGCaMP8f med holografisk belysning kör du skriptfilen SLMcontrol.m. Klicka på referensbilden och välj bilden ovan. Klicka sedan på knappen Spot för att välja specifika pixlar på neuronerna i bilden genom kontinuerligt musklick (figur 4A). Om valet är klart trycker du på Enter-knappen på tangentbordet för att slutföra det.Det digitala hologrammet beräknas automatiskt och visas på SLM. Detta mönster kan också ses över genom att klicka på en listruta. Den rumsliga upplösningen för en enda punkt genererad av SLM var ungefär 1,2 μm längs tvärriktningen och ~ 8,3 μm längs den optiska axeln. Vi använde en objektivlins med hög numerisk bländare (1.1) för att uppnå mer lokaliserad holografisk stimulering. Tabell 1 sammanfattar tidigare rapporter och detta system med avseende på den rumsliga upplösningen av holografisk stimulering. För att upptäcka neural aktivitet med hög tidsupplösning med hjälp av en bildsensor (se materialförteckning), ställ in exponeringstid, bildområde och binning (figur 4B) innan du utför bildinsamling (figur 4C).OBS: Intensiteten hos den holografiska belysningslasern (920 nm) som kontinuerligt stimulerar en neuron är 2 mW, vilket är tillräckligt för att detektera neural aktivitet. Till exempel, för att uppnå en bildhastighet på 100 Hz för avbildning, är exponeringstiden 9 ms, bildområdet är 400 μm × 400 μm och binningen är 4. Efter experimentet, återför musen till sin hembur. 5. Tvåfotonavbildning (punktskanningsläge) med optogenetik med hjälp av ett holografiskt mikroskop (figur 2) Upprepa steg 4.1 och 4.2. Slå på programvaran för kommersiell bildbehandling (se Materialförteckning). I livebildsläget justerar du bilddetektorns spänning (se Materialförteckning) och bildlaserns effekt för att optimera ljusstyrkan hos neuronerna som uttrycker GCaMP6m-P2A-ChRmine. Ta bilder av neuronerna som uttrycker dessa proteiner (figur 1E). Upprepa steg 4.4. För att undersöka den funktionella anslutningen inom L2/3-neuroner, använd en SLM för att generera holografiska mönster av optogenetisk stimulering (ChRmine; 1,040 nm) och kombinera den med tvåfoton-Ca 2+ avbildning (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pixlar, 2 Hz eller 30 Hz,2x digital zoom, punktskanningsläge; Figur 4D-H).För detta protokoll, ställ in intensiteten på bildlasern till 920 nm, vid 10-20 mW, och FOV som 256 μm × 256 μm mätt på ett djup av 100-150 μm från den kortikala ytan. Ställ in pixeluppehållstiden på 1,5 μs för 2 Hz eller 100 ns för 30 Hz. För att se om en enda holografisk stimulans orsakade ett kalciumsvar i neuronerna, använd både 2 Hz och 30 Hz som bildhastighet. Ställ in intensiteten hos den holografiska stimuleringslasern (1 040 nm) som stimulerar en enda neuron vid 10 mW, vilket är tillräckligt för att inducera neural aktivitet (figur 4D).OBS: Den rumsliga upplösningen för en enda punkt som genereras av SLM är ungefär 1,2 μm längs tvärriktningen och ~ 8,3 μm längs den optiska axeln. Området för tillgänglig volym i sidled är cirka 500 μm × 500 μm och 100 μm i axiell riktning. Vi har vidare bekräftat med Ca2+ avbildning vid 2 Hz eller 30 Hz bildhastighet att inte bara en neuron utan flera neuroner kan stimuleras holografiskt samtidigt (figur 4E). Utför bildinsamling med följande protokoll: avbilda samtidigt Ca2+ -responsen vid 920 nm med 10 holografiska stimuli vid 1 040 nm med 8 s-intervall (0,125 Hz) under en varaktighet av 50 ms efter en baslinjeperiod på 10 s. När alla experiment är färdiga avlivas mössen.OBS: Ca2+ transienter, om de förekom, framkallades genom holografisk stimulering, med sin topp inom 1 s efter stimulering (figur 4F-H). 6. Bildanalys och bedömning av funktionell konnektivitet (figur 4) Öppna de obehandlade bilderna som sparades i steg 4.5 eller 5.5 med ImageJ. För att kompensera för fokalplanets förskjutning, använd ImageJ plug-in TurboReg.OBS: Om korrigeringen med TurboReg inte är tillräcklig rekommenderas att CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) används för att korrigera fokalplanets förskjutning. För att bedöma neural aktivitet, bestäm de intressanta regionerna (ROI) i L2/3 med hjälp av en automatiserad algoritm (CaImAn). Detektera och analysera Ca2+ transienter efter att ha definierat baslinjens fluorescensintensitet (F0) och tröskelvärdet.Anmärkning: F0 är den 35:e percentilen av fluorescensintensiteten som erhållits under avbildningsperioden vid baslinjen. Ca2+ transienter betecknas med Δ F/F 0 (Δ F = F-F0), där F är den momentana fluorescenssignalen. Om Δ F-värdet är över 2 S.D. från F0 utvärderar vi en signifikant Ca2+ transient. För att definiera funktionell anslutning i L2/3-neuroner, stimulera målneuroner och mäta GCaMP6m-svar i stimulerade och omgivande neuroner, följaktligen (figur 4F-H).

Representative Results

Representativa inspelningar erhållna med den metod som beskrivs här presenteras. In vivo Ca2+ avbildning med holografisk mikroskopi kräver 2-4 veckor att slutföra från implantation av huvudplatta och AAV-injektion till datainsamling. För att få stabila resultat är det därför viktigt att minska rörelseartefakter i hjärnan. Implantationen av huvudplattan (steg 1.5) och placeringen av kranialfönstret (steg 2.9) är mycket viktiga steg i denna process. Dessutom är det också viktigt att välja en AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1) som samtidigt uttrycker kalciumindikator och opsin i en enda neuron (steg 2.8). Figur 4A visar en plats för holografisk belysning av en förvärvad neuronbild med hjälp av ett skräddarsytt MATLAB-skript. Om holografisk belysning framgångsrikt belyste neuronerna som uttrycker jGCaMP8f, kunde Ca2+ spår erhållas med en bildsensor (figur 4B), som visas i figur 4C. Funktionell anslutning mellan neuroner utvärderades med hjälp av holografisk stimulering (figur 4D), som visas i figur 4E. Eftersom funktionell anslutning mellan neuroner är en av de neurala kretsegenskaperna som förändras i patogenesen hos en smärtmodellmus24, beskriver vi en enkel procedur för att utvärdera den. Figur 4F visar en typisk bild av L2/3-neuroner i S1HL visualiserad med GCaMP6m. När en neuron (orange cirkel) holografiskt stimulerades var en annan neuron (röd cirkel) samtidigt aktiv; således var antalet funktionella anslutningar mellan neuroner en (Figur 4G). Figur 1: Schematisk översikt över försöksförfarandet . (A) Fixering av huvudplattan till skallen. (B) Stereotaktisk injektion av AAV i baktassområdet i den primära somatosensoriska cortexen (S1HL). (C) Implantering av kranialfönstret. För att bedöma och manipulera neural aktivitet utförs in vivo Ca2+ avbildning på vakna möss (D) med holografisk stimulering (E). Blixtmärken indikerar holografisk stimulering eller belysning. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: System som används för det holografiska mikroskopet. (A) Bilder av de holografiska stimulerings- och belysningsljusvägarna (vänster) nära mikroskopet (mitten) med en bildsensor (höger). (B) Dessa är förstorade bilder av holografisk stimulering och belysningsljusvägar runt respektive SLM (vänster och höger) och en punktskanningsljusväg runt ett skanningshuvud (mitten och höger). (C) En schematisk bild av de optiska stimulerings- och bildvägarna. Fasspecifika SLM används för att visa digitala hologram, och en strålexpanderare (en kombination av L1 och L2) och ett 4f-reläsystem (en kombination av L3 och L4 för holografisk stimulering och L4 och L5 för holografisk belysning) placeras före och efter respektive SLM för att säkerställa att varje digitalt hologram avbildas vid utgångspupillen i en objektivlins med vattennedsänkning. med något underfylld bildstorlek. För att undertrycka återstående nollordningskomponenter placeras ett strålblock vid mellanplanet. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 3: Flödesschema över hur man kalibrerar det holografiska stimulerings- eller belysningssystemet. Detta flödesschema beskriver steg för att kalibrera ett holografiskt stimulerings- eller belysningssystem till provutrymmet och bildsystemet. Besök steg 3, förberedelse för det holografiska stimulerings- eller belysningssystemet, för detaljerade instruktioner och ladda ner ett exempelprogram. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 4: Representativa resultat av avbildning och funktionell anslutning med hjälp av ett holografiskt mikroskop . (A) För att belysa specifika neuroner som uttrycker jGCaMP8f eller GCaMP6m-P2A-ChRmine fångas bilden av neuroner och sedan bildas en plats på neuronen med hjälp av ett skräddarsytt MATLAB-skript. (B) Inställning av bildsensorn (exponeringstid, bildområde och binning). (C) Representativ bild och spår av neuroner som uttrycker jGCaMP8f i 100 Hz-avbildning med holografisk belysning och en bildsensor. (D) Denna graf visar det neurala svaret på holografisk stimulering (1 040 nm) vid varje lasereffekt (data från GCaMP6m-P2A-ChRmine som uttrycker neuroner vid bildhastighet på 2 Hz [n = 16]). Felstaplar anger medelvärdets standardfel. (E) Representativa Ca2+ spår under holografisk stimulering (blå vertikala linjer) av 10 olika neuroner vid bildhastigheter på 2 Hz (vänster) och 30 Hz (höger). I spår av 2 Hz och 30 Hz Ca2+ indikerar samma färg samma neuron. (F) Schematiskt diagram som utvärderar funktionella samband mellan neuroner. När den orange neuronen stimuleras svarar de röda neuronerna samtidigt, vilket indikerar att det finns funktionell anslutning mellan dessa neuroner. (G) En typisk bild av S1HL-neuroner som uttrycker GCaMP6m i WT. Skalstapel = 10 μm. (H) Typiska Ca2+ spår under holografisk stimulering (blå vertikala linjer) vid bildhastigheter på 2 Hz (övre) och 30 Hz (lägre). Den stimulerade neuronen cirklas i orange, svarande neuroner cirklas i rött och icke-svarande neuroner cirklas i grått. Neural respons på holografisk stimulering kan detekteras vid både 2 Hz och 30 Hz avbildningshastigheter. Klicka här för att se en större version av denna figur. Vårt upplägg 6  Prakash, R. et al. 25  Marshel, J. H. et al. 12 Robinson, N. T. M. et al. 14 Lateral upplösning 1,2 μm 1,27 μm ― 2,22 μm Axiell upplösning 8,3 μm 56,86 μm 15,5 μm 10,26 μm Objektiv / numerisk bländare 25x/1.1 20x/0,5 16x/0,8 16x/0,8 Tabell 1: Sammanfattning av tidigare rapporter och detta system för rumslig upplösning av holografisk stimulering. Den laterala upplösningen, axiell upplösning och objektivlinsen som används under mätningen beskrivs.

Discussion

För att förstå hjärnans funktion är det nödvändigt att noggrant bedöma de neurala kretsarna som ligger till grund för hjärnfunktionen genom att extrahera dynamiken i neural aktivitet. Dessutom är det viktigt att identifiera hur denna neurala krets förändras för att belysa patogenesen av neuropsykiatriska störningar. Det är faktiskt känt att neural aktivitet är förhöjd i musmodeller av Alzheimers sjukdom4 och bräckligt X-syndrom26 och möss med nedsatt vitsubstansfunktion3. Dessutom, i en musmodell av inflammatorisk smärta, är ökad synkronisering av neural aktivitet och funktionell anslutning mellan neuroner associerad med symtom24. Tvåfotonholografisk mikroskopi gör det möjligt för oss att samtidigt observera aktiviteten hos enskilda neuroner och de funktionella kopplingarna mellan neuroner, vilket är nödvändigt för att förstå neurala kretsar. Vi använde en 25x objektivlins med numerisk bländare = 1,1 med våglängder på 1 040 nm. Den teoretiska punktspridningsfunktionen är en gaussisk fördelning med full bredd vid halva maximalt 0,5 μm lateralt och 1,7 μm axiellt. Den faktiska numeriska bländaren är dock mindre än 1,1, och den uppmätta punktstorleken på en fluorescenssträng är 1,2 μm i sidled och 8,3 μm axiellt. Med tanke på att neurondiametern är cirka 15 μm och kalibreringsfelet ligger inom 3 μm är inriktningen generellt bra. Celler i axiell riktning kan dock påverkas av den längre punktstorleken6. Här beskrev vi viral injektion, kirurgi, kalibrering av holografiska stimulerings- eller belysningssystem och avbildningsprotokoll för utvärdering och manipulering av neural aktivitet hos levande möss med hjälp av vårt mikroskopisystem.

Det tar 2-4 veckor att slutföra alla experimentella procedurer, från implantation av huvudplattor och virusinjektion till datainsamling för in vivo Ca2+ avbildning med holografisk mikroskopi. Processen är komplex och mödosam, och experimentets slutliga framgång beror på flera faktorer, inklusive kranialfönstrets tillstånd, som påverkas av postoperativ inflammation, rätt val av Ca2+ indikator och opsin, och om rörelseartefakter i de förvärvade bilderna kan korrigeras. I synnerhet är två steg viktiga för ett framgångsrikt resultat. Den första gäller fixering och kirurgi av huvudplattor; Det är viktigt att huvudplattan är ordentligt fastsatt på mushuvudet med tandcement. Dessutom är det viktigt att upprepade gånger rengöra benfragment och koagulerat blod med kall ACSF under operationen. Eftersom vidhäftning till denna procedur minskar inflammation observerade vi framgångsrikt dynamiken hos microglia, cellerna som är ansvariga för hjärnans immunsystem, utan att aktivera deras processer och spines eller mikrostrukturerna hos neuroner27,28. Den andra frågan är utvärdering och manipulation av neural aktivitet. Vi valde AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 för att uttrycka Ca2+ indikatorn och opsin i en neuron samtidigt. Detta beror på att det är svårt att effektivt infektera en neuron med olika AAV-typer. En annan anledning till detta val var att ChRmine effektivt kan aktivera neural aktivitet vid 1 040 nm med hjälp av en tvåfotonlaser12. Nyligen har det rapporterats att ChRmine, genom att mutera sin struktur baserat på strukturell information erhållen genom kryoelektronmikroskopi, förbättrar dess funktion29, vilket anses vara användbart för målfunktionsanalys inom neurovetenskap. Mot bakgrund av dessa problem är det nödvändigt att dela effektiva metoder för att utvärdera och manipulera neuroner vid läsning av neural aktivitet och skriva information med hjälp av holografisk mikroskopi.

Nya framsteg inom avbildning och optogenetik har avslöjat den detaljerade neurala aktiviteten som är involverad i hjärnfunktioner som inlärning och minne, och det är möjligt att artificiellt manipulera denna neurala aktivitet för att uttrycka hjärnfunktioner30. Konventionella metoder för manipulation av neural aktivitet är emellertid mycket invasiva på grund av införandet av optiska fibrer i hjärnan och eftersom en grupp opsinuttryckande celler stimuleras samtidigt, vilket gör det omöjligt att manipulera neural aktivitet med tidsmässig och rumslig precision. Vår metod kan manipulera neural aktivitet genom att stimulera endast specifika nervceller i hjärnan, vilket möjliggör manipulation av neural aktivitet med specifika stimuleringsmönster och hög spatiotemporal upplösning. Vidare är det viktigt att notera att funktionell anslutning mellan neuroner endast kan utvärderas i ett litet antal neuroner med hjälp av hjärnskivexperiment31; Denna teknik möjliggör emellertid samtidig utvärdering av flera neuroner hos levande djur.

En av de största begränsningarna i nuvarande holografiska mikroskop är behovet av att fixa mushuvudet, vilket begränsar musens beteende. Nyligen utvecklades ett miniatyriserat tvåfotonmikroskop32, och med ytterligare miniatyrisering av enheten kan in vivo Ca2+ -avbildning med holografisk stimulering vara möjlig i fritt rörliga möss. Dessutom kan potentialen hos detta mikroskop utökas genom att förbättra den tidsmässiga upplösningen av avbildning och kombinera den med mycket känsliga spänningskänsliga fluorescerande proteiner33.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden (19H04753, 19H05219 och 25110732 till H. W.), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 till H. W., 20H05886 till O. M. och 21H05587 till D. K.), Främjande av gemensam internationell forskning (B) (20KK0170 till H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 till H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (21H04663 till O. M.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (20K15193 till X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japan, och JST A-STEP Grant Number JPMJTR204C.

Materials

25x Objective Nikon N25X-APO-MP Objective
A1MP Nikon A1MP Microscope
AnesII Bio machinery AnesII Anesthesia delivery system
C2 plus Nikon C2 plus Microscope
DECADRON Phosphate Injection Aspen 21N024 Avoid cerebral edema
Dental Drill Jota C1.HP.005 Dental drill
Electric Microinjector NARISHIGE IM-31 Pressure injection system
FEATHERS FEARGER FA-10 Shaving
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER GC 2110271 Resin cement primer for dental adhesion
G-CEM ONE neo GC 43093 Resin cement for dental adhesion
Glass Capillary with Filament NARISHIGE GDC-1 Glass capillary
Image Detector Hamamatsu H10770PA-40 GaAsP photocathode photomultiplier tube
Imaging Software Nikon NISelements Imaging software
Isoflurane Inhalation Solution Pfizer 229KAR Anesthetics
iXon EMCCD Camera Andor iXon Life 888 Image sensor
Ketamine daiitisannkyou s9-018506 Anesthetics
Leica-M60 Leica M60 Stereoscope
Linicon Linicon LV-125 Vacuum pump
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser  Coherent Chameleon Discovery NX Femtosecond laser
Mos-Cure U-VIX mini 365 Portable LED UV Light Source
PEN Bright SHOFU INC. PEN Bright Dental light curing unit
Puller SUTTER instaument P-97 Puller
Stereotaxic Instrument (for Mice) NARISHIGE SR-6M-H Stereotaxic instrument
Stereotaxic Micromanipulator NARISHIGE SM-15R Stereotaxic micromanipulator
Super-Bond CATALYST V SUN MEDICAL 8070 Dental adhesive resin cement
Super-Bond Dental Adhesive Monomer SUN MEDICAL 8071 Dental adhesive monomer
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder SUN MEDICAL 145052000 Teeth color polymer powder
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% Santen Pharmaceutical  TRN3952 Eye ointment
UlTIMATE XL NSK Y141446 Dental laboratory micromotor control unit
UV Curing Optical Adhesives THORLABS NOA61 UV Curing Optical Adhesives
Xylazine Bayer KP0F2BK Anesthetics
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
  2. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  3. Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
  4. Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  6. Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
  7. Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  9. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  10. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
  11. Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
  12. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  13. Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
  14. Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
  17. Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671 (2018).
  18. Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
  19. Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228 (2017).
  20. Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
  21. Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
  22. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
  23. Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928 (2016).
  24. Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261 (2021).
  25. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  26. Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  27. Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
  28. Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816 (2019).
  29. Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
  30. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  31. Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
  32. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
  33. Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).

Tags

Keywords: Two-photon Holographic MicroscopyNeuroactivityNeural Activity ManipulationSpatial Temporal ResolutionNeuropsychiatric DisordersAAV InjectionAgarose Brain WindowHolographic Stimulation System
check_url/pt/64205?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kato, D., Quan, X., Tanisumi, Y., Guo, Z., Morita, M., Takiguchi, T., Matoba, O., Wake, H. Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64205, doi:10.3791/64205 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image