Studio della cooperazione microbica mediante spettrometria di massa per immagini Analisi di colonie batteriche cresciute su agar e nei tessuti durante l'infezione

Il microbioma umano è un ecosistema altamente dinamico che coinvolge interazioni molecolari di batteri, virus, archea e altri eucarioti microbici. Mentre le relazioni microbiche sono state intensamente studiate negli ultimi anni, molto resta da capire sui processi microbici a livello chimico ^1,2. Ciò è in parte dovuto all’indisponibilità di strumenti in grado di misurare con precisione ambienti microbici complessi. I progressi nel campo della spettrometria di massa per immagini (IMS) nell’ultimo decennio hanno permesso la mappatura spaziale in situ e label-free di molti metaboliti, lipidi e proteine in substrati biologici ^3,4. Il desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI) è emerso come la tecnica di ionizzazione più comune utilizzata nella spettrometria di massa di imaging, che prevede l’uso di un laser UV per ablare materiale dalla superficie di una sezione di tessuto sottile per la misurazione mediante spettrometria di massa⁴. Questo processo è facilitato dall’applicazione di una matrice chimica applicata in modo omogeneo alla superficie del campione, consentendo di effettuare misurazioni sequenziali in uno schema raster sulla superficie del campione. Le mappe termiche delle intensità degli ioni analita vengono quindi generate in seguito all’acquisizione dei dati. I recenti progressi nelle sorgenti di ionizzazione e nelle tecniche di campionamento hanno permesso l’analisi di substrati non tradizionali come campioni cellulari batterici⁵ e ^6,7,8 di mammiferi cresciuti su agar nutriente. Le informazioni spaziali molecolari fornite dall’IMS possono fornire una visione unica della comunicazione biochimica delle interazioni microbo-microbo e ospite-microbo durante l’infezione 9,10,11,12,13,14.

Dopo l’infezione da Clostridioides difficile (CDI), C. difficile è esposto a un ambiente microbico in rapida evoluzione nel tratto gastrointestinale, dove le interazioni polimicrobiche possono avere un impatto sugli esiti dell’infezione^15,16. Sorprendentemente, si sa poco sui meccanismi molecolari delle interazioni tra C. difficile e microbiota residente durante l’infezione. Ad esempio, gli enterococchi sono una classe di patogeni commensali opportunistici nel microbioma intestinale e sono stati associati ad una maggiore suscettibilità e gravità di CDI^17,18,19,20. Tuttavia, si sa poco sui meccanismi molecolari delle interazioni tra questi patogeni. Per visualizzare la comunicazione di piccole molecole tra questi membri del microbioma intestinale, macrocolonie batteriche sono state coltivate qui su agar per simulare le interazioni microbi-microbi e la formazione di biofilm batterico in un ambiente controllato. Tuttavia, ottenere distribuzioni metaboliche rappresentative dopo l’analisi della spettrometria di massa di imaging MALDI di campioni di coltura batterica è difficile a causa dell’elevato contenuto di acqua e della topografia superficiale irregolare di questi campioni. Ciò è in gran parte causato dalla natura altamente idrofila dell’agar e dalla risposta superficiale non uniforme dell’agar durante la rimozione dell’umidità.

L’elevato contenuto di acqua dell’agar può anche rendere difficile ottenere un rivestimento omogeneo della matrice MALDI e può interferire con la successiva analisi MALDI eseguita nel vuoto²¹. Ad esempio, molte sorgenti MALDI operano a pressioni di 0,1-10 Torr, che è un vuoto sufficiente per rimuovere l’umidità dall’agar e può causare la deformazione del campione. Questi cambiamenti morfologici nell’agar indotti dall’ambiente sottovuoto causano gorgogliamento e fessurazioni nel materiale di agar essiccato. Questi artefatti riducono l’aderenza dell’agar al vetrino e possono causare lo smontaggio o lo sfaldamento del campione nel sistema di vuoto dello strumento. Lo spessore dei campioni di agar può arrivare fino a 5 mm dal vetrino, il che può creare un gioco insufficiente dall’ottica ionica all’interno dello strumento, causando contaminazione e/o danni all’ottica ionica dello strumento. Questi effetti cumulativi possono comportare riduzioni del segnale ionico che riflette la topografia superficiale, piuttosto che le interazioni biochimiche microbiche sottostanti. I campioni di agar devono essere essiccati in modo omogeneo e fortemente aderenti a un vetrino da microscopio prima dell’analisi sottovuoto.

Questo documento dimostra un flusso di lavoro di preparazione del campione per l’essiccazione controllata di macrocolonie di coltura batterica coltivate su terreni di agar. Questo processo di essiccazione più lento e in più fasi (rispetto a quelli precedentemente riportati) assicura che l’agar si disidrati uniformemente, riducendo al minimo gli effetti del gorgogliamento o della fessurazione dei campioni di agar montati su vetrini da microscopio. Utilizzando questo metodo di essiccazione graduale, i campioni sono fortemente aderenti al vetrino del microscopio e suscettibili per la successiva applicazione della matrice e l’analisi MALDI. Questo è esemplificato utilizzando colonie batteriche modello di C. difficile coltivate su modelli di tessuto agar e murino che ospitano CDI con e senza la presenza di patogeno commensale e opportunista, Enterococcus faecalis. Le analisi di spettrometria di massa di imaging MALDI di modelli batterici e tissutali consentono la mappatura spaziale dei profili dei metaboliti degli amminoacidi, fornendo nuove informazioni sul metabolismo e sulla comunicazione microbica bioenergetica.