イメージング質量分析 による 寒天上および感染組織内で増殖した細菌コロニーの微生物連携の検討

ヒトマイクロバイオームは、細菌、ウイルス、古細菌、およびその他の微生物真核生物の分子相互作用を含む非常に動的な生態系です。近年、微生物の関係が熱心に研究されていますが、化学レベルでの微生物プロセスについては多くのことが理解されていません^1,2。これは、複雑な微生物環境を正確に測定できるツールが利用できないことが一因です。過去10年間のイメージング質量分析(IMS)の分野における進歩により、生物学的基質中の多くの代謝物、脂質、およびタンパク質のin situおよびラベルフリーの空間マッピングが可能になりました^3,4。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)は、質量分析による測定のために薄い組織切片の表面から材料をアブレーションするためにUVレーザーを使用することを含む、イメージング質量分析で使用される最も一般的なイオン化技術として浮上^{しています4}。このプロセスは、サンプルの表面に均一に塗布された化学マトリックスの適用によって促進され、サンプル表面全体のラスターパターンで連続的な測定を行うことができます。分析種のイオン強度のヒートマップは、データ収集後に生成されます。イオン化源とサンプリング技術の最近の進歩により、栄養寒天上で増殖した細菌⁵や哺乳類^の6,7,8細胞標本などの非伝統的な基質の分析が可能になりました。IMSが提供する分子空間情報は、感染中の微生物-微生物および宿主-微生物相互作用の生化学的コミュニケーションに関する独自の洞察を提供することができます9,10,11,12,13,14。

クロストリジオイデス・ディフィシル感染(CDI)の際、 C.ディフィシル 胃腸管の急速に変化する微生物環境にさらされ、ポリ微生物相互作用が感染結果に影響を与える可能性があります^15,16。驚くべきことに、感染中のC.ディフィシルと常在微生物叢との相互作用の分子メカニズムについてはほとんど知られていません。たとえば、腸球菌は腸内細菌叢における日和見共生病原体のクラスであり、CDI^17,18,19,20に対する感受性と重症度の増加に関連しています。しかし、これらの病原体間の相互作用の分子メカニズムについてはほとんど知られていません。腸内細菌叢のこれらのメンバー間の低分子コミュニケーションを視覚化するために、細菌マクロコロニーを寒天上で増殖させ、制御された環境での微生物間相互作用および細菌バイオフィルム形成をシミュレートした。しかし、細菌培養標本のMALDIイメージング質量分析分析で代表的な代謝分布を得ることは、これらの試料の含水率が高く、表面トポグラフィーが不均一であるため、困難です。これは主に、寒天の親水性が高く、水分除去時の寒天表面応答が不均一であることに起因しています。

寒天の含水率が高いと、均質なMALDIマトリックスコーティングを達成することが困難になり、真空中で実行されるその後のMALDI分析が妨げられる可能性があります²¹。例えば、多くのMALDI源は0.1〜10 Torrの圧力で動作し、これは寒天から水分を除去するのに十分な真空であり、サンプルの変形を引き起こす可能性があります。真空環境によって誘発される寒天のこれらの形態変化は、乾燥した寒天材料にバブリングと亀裂を引き起こします。これらのアーチファクトは、寒天のスライドへの付着を減らし、機器の真空システムへのサンプルの降車または剥離を引き起こす可能性があります。寒天サンプルの厚さはスライドから最大5mm離れているため、装置内のイオン光学系からのクリアランスが不十分になり、機器のイオン光学系に汚染や損傷を引き起こす可能性があります。これらの累積的な効果は、根底にある微生物の生化学的相互作用ではなく、表面トポグラフィーを反映するイオンシグナルの減少をもたらす可能性があります。寒天サンプルは、真空中で分析する前に、均一に乾燥し、顕微鏡スライドに強く接着する必要があります。

この論文は、寒天培地上で増殖した細菌培養マクロコロニーの制御された乾燥のためのサンプル調製ワークフローを示しています。この多段階の遅い乾燥プロセス(以前に報告されたものと比較して)は、顕微鏡スライドに取り付けられた寒天サンプルの泡立ちや亀裂の影響を最小限に抑えながら、寒天が均一に脱水することを保証します。この段階的な乾燥方法を使用することにより、サンプルは顕微鏡スライドに強く接着され、その後のマトリックス塗布およびMALDI分析に適しています。これは、寒天およびマウス組織モデル上で増殖した C.ディフィシル のモデル細菌コロニーを用いて例示され、共生および日和見病原体であるエンテロコッカス・フェカリスの存在の有無にかかわらずCDIを保有する。細菌モデルと組織モデルの両方のMALDIイメージング質量分析分析により、アミノ酸代謝物プロファイルの空間マッピングが可能になり、生体エネルギー微生物の代謝とコミュニケーションに関する新しい洞察が得られます。