Étude de la coopération microbienne par imagerie par spectrométrie de masse Analyse de colonies bactériennes cultivées sur gélose et dans les tissus pendant l’infection

Le microbiome humain est un écosystème hautement dynamique impliquant des interactions moléculaires de bactéries, de virus, d’archées et d’autres eucaryotes microbiens. Bien que les relations microbiennes aient été intensément étudiées ces dernières années, il reste encore beaucoup à comprendre sur les processus microbiens au niveau chimique ^1,2. Cela est dû en partie à l’indisponibilité d’outils capables de mesurer avec précision des environnements microbiens complexes. Les progrès réalisés dans le domaine de la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) au cours de la dernière décennie ont permis une cartographie spatiale in situ et sans marquage de nombreux métabolites, lipides et protéines dans les substrats biologiques ^3,4. La désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est devenue la technique d’ionisation la plus couramment utilisée en spectrométrie de masse par imagerie, impliquant l’utilisation d’un laser UV pour enlever du matériau de la surface d’une section mince de tissu pour la mesure par spectrométrie de masse⁴. Ce processus est facilité par l’application d’une matrice chimique appliquée de manière homogène à la surface de l’échantillon, ce qui permet d’effectuer des mesures séquentielles selon un motif raster sur toute la surface de l’échantillon. Des cartes thermiques des intensités ioniques de l’analyte sont ensuite générées après l’acquisition des données. Les progrès récents dans les sources d’ionisation et les techniques d’échantillonnage ont permis l’analyse de substrats non traditionnels tels que les spécimens cellulaires bactériens⁵ et ^6,7,8 mammifères cultivés sur gélose nutritive. L’information spatiale moléculaire fournie par l’IMS peut fournir un aperçu unique de la communication biochimique des interactions microbe-microbe et hôte-microbe pendant l’infection 9,10,11,12,13,14.

Lors de l’infection à Clostridioides difficile (ICD), C. difficile est exposé à un environnement microbien en évolution rapide dans le tractus gastro-intestinal, où les interactions polymicrobiennes sont susceptibles d’avoir une incidence sur les résultats de l’infection^15,16. Étonnamment, on sait peu de choses sur les mécanismes moléculaires des interactions entre C. difficile et le microbiote résident au cours de l’infection. Par exemple, les entérocoques sont une classe d’agents pathogènes commensales opportunistes dans le microbiome intestinal et ont été associés à une sensibilité accrue et à une gravité accrue de l’ICD 17,18,19,20. Cependant, on sait peu de choses sur les mécanismes moléculaires des interactions entre ces agents pathogènes. Pour visualiser la communication des petites molécules entre ces membres du microbiome intestinal, des macrocolonies bactériennes ont été cultivées ici sur gélose pour simuler les interactions microbe-microbe et la formation de biofilm bactérien dans un environnement contrôlé. Cependant, l’obtention de distributions métaboliques représentatives lors de l’analyse par spectrométrie de masse par imagerie MALDI d’échantillons de culture bactérienne est difficile en raison de la teneur élevée en eau et de la topographie de surface inégale de ces échantillons. Ceci est dû en grande partie à la nature hautement hydrophile de la gélose et à la réponse non uniforme de la surface de la gélose lors de l’élimination de l’humidité.

La teneur élevée en eau de la gélose peut également rendre difficile l’obtention d’un revêtement matriciel MALDI homogène et peut interférer avec l’analyse MALDI ultérieure effectuée sous vide²¹. Par exemple, de nombreuses sources MALDI fonctionnent à des pressions de 0,1 à 10 Torr, ce qui constitue un vide suffisant pour éliminer l’humidité de la gélose et peut provoquer une déformation de l’échantillon. Ces changements morphologiques dans la gélose induits par l’environnement sous vide provoquent des bulles et des fissures dans la gélose séchée. Ces artefacts réduisent l’adhérence de la gélose à la lame et peuvent provoquer le démontage ou l’écaillage de l’échantillon dans le système de vide de l’instrument. L’épaisseur des échantillons de gélose peut atteindre 5 mm de la lame, ce qui peut créer un dégagement insuffisant de l’optique ionique à l’intérieur de l’instrument, provoquant une contamination et/ou des dommages à l’optique ionique de l’instrument. Ces effets cumulatifs peuvent entraîner des réductions du signal ionique reflétant la topographie de surface, plutôt que les interactions biochimiques microbiennes sous-jacentes. Les échantillons de gélose doivent être séchés de façon homogène et fortement collés à une lame de microscope avant d’être analysés sous vide.

Cet article démontre un flux de travail de préparation d’échantillons pour le séchage contrôlé de macrocolonies de culture bactérienne cultivées sur des milieux gélosés. Ce processus de séchage plus lent en plusieurs étapes (par rapport à ceux signalés précédemment) garantit que la gélose se déshydratera uniformément tout en minimisant les effets de bulles ou de fissuration des échantillons de gélose montés sur des lames de microscope. En utilisant cette méthode de séchage progressif, les échantillons adhèrent fortement à la lame de microscope et se prêtent à une application ultérieure de matrice et à une analyse MALDI. Ceci est illustré par des colonies bactériennes modèles de C. difficile cultivées sur des modèles de gélose et de tissus murins hébergeant des ICD avec et sans la présence d’un agent pathogène commensale et opportuniste, Enterococcus faecalis. Les analyses de spectrométrie de masse d’imagerie MALDI des modèles bactériens et tissulaires permettent la cartographie spatiale des profils de métabolites d’acides aminés, fournissant de nouvelles informations sur le métabolisme microbien bioénergétique et la communication.