通过成像质谱分析 研究 感染期间琼脂和组织中生长的细菌菌落的微生物合作

人类微生物组是一个高度动态的生态系统，涉及细菌、病毒、古细菌和其他微生物真核生物的分子相互作用。虽然近年来对微生物关系进行了深入研究，但在^{化学水平上}对微生物过程仍有许多了解1^，2。这部分是由于没有能够准确测量复杂微生物环境的工具。过去十年来，成像质谱（IMS）领域的进展使生物底物中的许多代谢物，脂质和蛋白质的原位和无标记空间映射成为可能3^，4。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）已成为成像质谱中最常用的电离技术，涉及使用紫外激光从薄组织切片表面烧蚀材料，以通过质谱法4进行^测量。通过将化学基质均匀地应用于样品表面，可以在整个样品表面上以光栅模式进行连续测量，从而促进了这一过程。然后在数据采集后生成分析物离子强度的热图。电离源和采样技术的最新进展使得能够分析非传统底物，例如在营养琼脂上生长的细菌⁵和哺乳动物^6，7，8细胞标本。IMS提供的分子空间信息^{可以为感染过程中}微生物-微生物和宿主-微生物相互作用的生化通讯提供独特的见解9，^10，11，¹²，^13，14。

艰难梭菌感染 （CDI） 后，艰难梭菌暴露于胃肠道中快速变化的微生物环境中，其中多种微生物相互作用可能会影响感染结果^15，16。令人惊讶的是，人们对感染期间艰难梭菌和常驻微生物群之间相互作用的分子机制知之甚少。例如，肠球菌是肠道微生物组中的一类机会性共生病原体，与 CDI¹⁷、^18、19、20 的易感性和严重程度增加有关。然而，对这些病原体之间相互作用的分子机制知之甚少。为了可视化肠道微生物组这些成员之间的小分子通讯，本文在琼脂上生长细菌大菌落以模拟受控环境中的微生物-微生物相互作用和细菌生物膜形成。然而，由于细菌培养标本的高含水量和不均匀的表面形貌，通过MALDI成像质谱分析获得具有代表性的代谢分布具有挑战性。这主要是由琼脂的高度亲水性和去除水分过程中琼脂表面反应不均匀引起的。

琼脂的高含水量也使得获得均匀的MALDI基质包衣变得具有挑战性，并可能干扰随后在真空中进行的MALDI分析²¹。例如，许多MALDI源在0.1-10托的压力下运行，这是一个足够的真空，可以从琼脂中去除水分，并可能导致样品变形。真空环境引起的琼脂中的这些形态变化导致干燥琼脂材料起泡和开裂。这些伪影会降低琼脂对载玻片的粘附，并可能导致样品拆卸或剥落到仪器真空系统中。琼脂样品的厚度可能与载玻片相距5 mm，这会导致仪器内部离子光学元件的间隙不足，从而导致仪器离子光学元件受到污染和/或损坏。这些累积效应可以导致反映表面形貌的离子信号减少，而不是潜在的微生物生化相互作用。琼脂样品必须均匀干燥，并在真空分析之前牢固地粘附在显微镜载玻片上。

本文展示了一种用于控制在琼脂培养基上生长的细菌培养物大菌落干燥的样品制备工作流程。这种多步骤、较慢的干燥过程（相对于先前报道的过程）可确保琼脂均匀脱水，同时最大限度地减少安装在显微镜载玻片上的琼脂样品冒泡或开裂的影响。通过使用这种逐渐干燥的方法，样品牢固地粘附在显微镜载玻片上，并适合随后的基质应用和MALDI分析。这使用在琼脂和鼠组织模型上生长的 艰难梭菌 模型来举例说明，这些模型具有和不存在共生和机会性病原体粪肠球菌。细菌和组织模型的MALDI成像质谱分析允许氨基酸代谢物谱的空间映射，为生物能量微生物代谢和通讯提供新的见解。