Le finestre craniche sono diventate onnipresenti nei campi delle neuroscienze, dell’ingegneria neurale e della biologia per consentire la visualizzazione diretta e l’imaging della corteccia negli animali viventi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . La potente combinazione di topi transgenici e imaging multifotonico ha fornito informazioni estremamente preziose sull’attività dei circuiti e altre intuizioni biologiche nel cervello in vivo 12,13,14,15,16,17,18. I microscopi miniaturizzati montati sul cranio hanno ulteriormente esteso queste capacità per consentire registrazioni in animali svegli e in movimento libero¹⁹. Il processo di creazione di una finestra cranica richiede una perforazione elettrica per assottigliare o rimuovere completamente l’osso cranico per produrre craniotomie abbastanza grandi da fissare un pezzo di vetro trasparente sopra la corteccia²⁰. Anche il polidimetilsilossano (PDMS) e altri polimeri sono stati testati come materiali cranici per finestre ^9,21. In definitiva, la finestra cranica ideale è quella che non altera o interferisce con la normale attività endogena sottostante. Tuttavia, è comunemente accettato che la perforazione della finestra cranica aggrava il tessuto sottostante, portando a danni al cervello, interruzione dell’ambiente e influenzando le meningi fino al punto di occludere la profondità di imaging multifotonico²². La neuroinfiammazione risultante ha una vasta gamma di effetti che vanno dalla permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB), all’attivazione e al reclutamento delle cellule gliali intorno al sito dell’impianto²³. Pertanto, caratterizzare metodi di perforazione della finestra cranica più sicuri e riproducibili è fondamentale per una qualità di imaging costante e per ridurre i fattori confondenti.

Mentre si presta attenzione a ridurre al minimo il trauma al tessuto sottostante, l’atto di perforare l’osso ha il potenziale di causare perturbazioni sia termiche che meccaniche al cervello^24,25. Il trauma meccanico dovuto alla penetrazione accidentale del trapano nella dura può ulteriormente indurre vari gradi di lesioni corticali²⁴. In uno studio di Shoffstall et al.25, il calore della perforazione ossea ha provocato un aumento della permeabilità alla BBB, come indicato dalla presenza di colorante Evans Blue (EB) nel parenchima cerebrale ²⁵. Il colorante EB, iniettato per via endovenosa, si lega all’albumina circolante nel sangue e quindi normalmente non attraversa una BBB sana in concentrazioni apprezzabili. Di conseguenza, il colorante EB è comunemente usato come marcatore sensibile della permeabilità alla BBB^26,27. Mentre il loro studio non ha misurato direttamente l’impatto della permeabilità della BEE sulle successive sequele biologiche in studio, studi precedenti hanno correlato la permeabilità della BBB a una maggiore risposta neuroinfiammatoria ai microelettrodi cronicamente impiantati e alle alterazioni della funzione motoria²⁸.

A seconda degli obiettivi dello studio, l’entità del danno termico e meccanico può contribuire a una fonte di errore sperimentale, influenzando negativamente il rigore e la riproducibilità dello studio. Esistono dozzine di metodi citati per la produzione di finestre craniche, ognuno dei quali utilizza diverse attrezzature di perforazione, velocità, tecniche e utenti 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 hanno riferito che la variazione osservata nei risultati del riscaldamento è stata attribuita alla variabilità della forza applicata del trapano, della velocità di avanzamento e dell’angolo di applicazione, tra gli altri aspetti che non possono essere controllati quando si perfora a mano ²⁵. Si ritiene che i sistemi di perforazione automatizzati e altre apparecchiature stereotassiche possano migliorare la riproducibilità e la coerenza dei risultati, ma gli studi sui metodi pubblicati non hanno valutato rigorosamente la temperatura o la permeabilità alla BEE come uno dei risultati. Pertanto, vi è la necessità di metodi più riproducibili e applicati in modo coerente per produrre finestre craniche, nonché metodi rigorosamente applicati per valutare l’impatto della perforazione della finestra cranica sul tessuto neurale sottostante.

L’obiettivo di questo studio è determinare e sviluppare metodi di perforazione coerenti e sicuri per le finestre craniche. La dimensione della craniotomia per l’installazione della finestra cranica è significativamente più grande delle craniotomie standard per i microelettrodi impiantati al cervello. Tali craniotomie non possono essere completate con un singolo foro di bava quando si utilizza l’attrezzatura standard, introducendo così una maggiore variabilità della tecnica interchirurgica quando eseguita a mano²⁰. I robot di perforazione chirurgica sono stati introdotti sul campo, ma non sono stati ampiamente adottati ^1,6,29. L’automazione della perforazione offre il controllo sulle variabili che contribuiscono alla variazione osservata da prova a prova, suggerendo che l’uso dell’attrezzatura può ridurre gli effetti inter- e intra-chirurgici. Ciò è di particolare interesse data la difficoltà aggiuntiva della craniotomia più grande necessaria per il posizionamento della finestra cranica. Mentre si potrebbe presumere che ci siano chiari benefici per il controllo fornito dall’automazione della perforazione, c’è stata poca valutazione dell’implementazione di queste attrezzature. Sebbene non siano state osservate lesioni visibili⁵, si desidera il test di sensibilità più elevato utilizzando EB.

Qui, la permeabilità alla BBB viene misurata utilizzando un robot di perforazione chirurgica disponibile in commercio con il relativo software, che consente la programmazione delle coordinate stereotassiche, la pianificazione / mappatura della craniotomia e una selezione di stili di perforazione (“punto per punto” vs “orizzontale”), riferendosi al percorso instradato della punta del trapano. Inizialmente, vengono perforati otto punti “seme” (Figura 1A), che delineano la finestra cranica. Da qui, lo spazio tra i semi viene ritagliato utilizzando il metodo di perforazione “punto per punto” o “orizzontale”. “Point-by-point” esegue tagli di fori pilota verticali (simili a una pressa per trapano CNC), mentre “orizzontale” esegue tagli orizzontali lungo la circonferenza della finestra cranica che delineano il foro (simile a un router CNC). Il risultato per entrambi i metodi è un pezzo di cranio che può essere rimosso per rivelare la finestra cranica. Per isolare i danni da perforazione, la finestra cranica non viene rimossa fisicamente, in modo da evitare ulteriori danni. Una combinazione di colorante EB accoppiato con imaging fluorescente viene utilizzata per misurare la permeabilità alla BBB dopo aver eseguito craniotomie nei topi e una termocoppia inserita viene utilizzata per misurare direttamente la temperatura della superficie cerebrale durante la perforazione (Figura 1B, C). Osservazioni precedenti hanno indicato che la perforazione pulsata on/off con intervalli di 2 s era sufficiente per mitigare il riscaldamento del trapano²⁵, e quindi è incorporata nell’approccio sperimentale per il robot chirurgico.

L’intento del lavoro presentato è quello di dimostrare i metodi di valutazione del danno termico da perforazione craniotomia. Mentre i metodi sono presentati nel contesto della perforazione automatizzata, tali metodi possono essere applicati anche a schemi di perforazione manuale. Questi metodi possono essere utilizzati per convalidare l’uso di attrezzature e / o schemi di perforazione prima di adottare come procedura standard.

Figura 1: Schema sperimentale della pipeline . Schema che dimostra il processo che gli animali sono stati sottoposti per la quantificazione dell’EB dopo la procedura della finestra cranica. (A) Configurazione schematica del mouse con telaio stereotassico e trapano robotico chirurgico. Un esempio di finestra cranica è mostrato sopra la corteccia motoria con punti seme (verde) e punti di bordo (blu). (B) La configurazione della perfusione include l’iniezione di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in tutto l’animale per rimuovere il sangue, seguita dall’estrazione del cervello. (C) Il cervello viene quindi messo nella camera del sistema di imaging fluorescente EB per condurre l’imaging fluorescente sul colorante blu Evans. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.