두개골 창은 신경 과학, 신경 공학 및 생물학 분야 전반에 걸쳐 유비쿼터스로 사용되어 살아있는 동물의 피질을 직접 시각화하고 이미징 할 수 있습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . 형질전환 마우스와 다광자 이미징의 강력한 조합은 생체 내 뇌 12,13,14,15,16,17,18에서 회로 활동 및 기타 생물학적 통찰력에 대한 매우 귀중한 통찰력을 제공했습니다. 두개골에 장착된 소형 현미경은 이러한 기능을 더욱 확장하여 깨어 있고 자유롭게 움직이는 동물을 기록할 수 있게 해주었다¹⁹. 두개골 창을 만드는 과정은 피질²⁰ 위에 투명한 유리 조각을 고정하기에 충분히 큰 개두술을 생성하기 위해 두개골 뼈를 얇게 또는 완전히 제거하기 위한 파워 드릴링이 필요합니다. 폴리디메틸실록산(PDMS) 및 기타 폴리머도 두개골 창 재료 ^9,21로 테스트되었습니다. 궁극적으로, 이상적인 두개골 창은 그 아래의 정상적인 내인성 활동을 변경하거나 방해하지 않는 창입니다. 그러나 두개골 창 드릴링은 기저 조직을 악화시켜 뇌 손상, 환경 파괴 및 다광자 이미징 깊이²²를 폐색하는 지점까지 수막에 영향을 미친다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있습니다. 결과적인 신경염증은 혈액-뇌 장벽(BBB)의 투과성에서 임플란트 부위 주변의 신경교 세포의 활성화 및 모집에 이르기까지 광범위한 효과를 갖는다⁽²³). 따라서 보다 안전하고 재현 가능한 두개골 창 드릴링 방법을 특성화하는 것은 일관된 이미징 품질과 교란 요인을 줄이는 데 매우 중요합니다.

밑에 있는 조직에 대한 외상을 최소화하기 위해 주의를 기울이는 동안, 뼈를 뚫는 행위는 뇌에 열적 및 기계적 섭동을 일으킬 가능성이 있습니다^24,25. 경막으로의 우발적인 드릴 침투로 인한 기계적 외상은 다양한 정도의 피질 손상을 추가로 유발할 수 있습니다²⁴. Shoffstall et al.25의 연구에서, 뼈 드릴링으로 인한 열은 뇌 실질에 Evans Blue(EB) 염료가 존재하는 것으로 나타난 바와 같이 BBB 투과성을 증가시켰습니다 ²⁵. 정맥 주사되는 EB 염료는 혈류에서 순환하는 알부민에 결합하므로 일반적으로 상당한 농도로 건강한 BBB를 통과하지 않습니다. 그 결과, EB 염료는 BBB 투과성^26,27의 민감한 마커로 일반적으로 사용됩니다. 그들의 연구는 연구 중인 후속 생물학적 후유증에 대한 BBB 투과성의 영향을 직접 측정하지는 않았지만, 이전 연구에서는 BBB 투과성을 만성적으로 이식된 미세전극에 대한 증가된 신경염증 반응 및 운동 기능의 변화와 연관시켰습니다²⁸.

연구의 목적에 따라 열적 및 기계적 손상의 정도가 실험 오류의 원인이 되어 연구의 엄격함과 재현성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 두개골 창을 생산하기 위해 인용 된 수십 가지 방법이 있으며, 각각 다른 드릴링 장비, 속도, 기술 및 사용자 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11을 사용합니다. Shoffstall et ^al.25는 관찰된 가열 결과의 변화가 드릴의 가해지는 힘, 이송 속도 및 적용 각도의 변동성에 기인한다고 보고했으며, 이는 손으로 드릴링할 때 제어할 수 없는 다른 측면 중에서도²⁵. 자동화된 드릴링 시스템 및 기타 정체 장비가 재현성과 결과 일관성을 향상시킬 수 있다는 믿음이 있지만 발표된 방법 연구에서는 결과 중 하나로 온도 또는 BBB 투과성을 엄격하게 평가하지 않았습니다. 따라서 두개골 창을 생성하기 위해 보다 재현 가능하고 일관되게 적용되는 방법과 기본 신경 조직에 대한 두개골 창 드릴링의 영향을 평가하기 위해 엄격하게 적용되는 방법이 필요합니다.

이 연구의 초점은 두개골 창에 대한 일관되고 안전한 드릴링 방법을 결정하고 개발하는 것입니다. 두개골 창 설치를 위한 개두술의 크기는 뇌 이식 미세전극을 위한 표준 개두술보다 훨씬 큽니다. 이러한 개두술은 표준 장비를 사용할 때 단일 버 구멍으로 완료할 수 없으며, 따라서 손으로 수행할 때 외과 의사 간 기술 가변성을 더 많이 도입한다⁽²⁰). 외과 용 드릴링 로봇이 현장에 도입되었지만 널리 채택되지는 않았습니다 ^1,6,29. 드릴링 자동화는 관찰된 시행 간 변동에 기여하는 변수에 대한 제어를 제공하며, 이는 장비 사용이 외과 간 및 외과 내 효과를 줄일 수 있음을 시사합니다. 이것은 두개골 창 배치에 필요한 더 큰 개두술의 추가 어려움을 감안할 때 특히 중요합니다. 시추 자동화를 통해 제공되는 제어에 분명한 이점이 있다고 가정할 수 있지만 이러한 장비의 구현에 대한 평가는 거의 없습니다. 눈에 보이는 병변은 관찰되지 않았지만⁵, EB를 이용한 더 높은 민감도 검사가 요구된다.

여기에서 BBB 투과성은 시중에서 판매되는 수술용 드릴링 로봇과 해당 소프트웨어를 사용하여 측정되며, 이를 통해 정위 좌표, 개두술 계획/매핑 및 드릴 비트의 라우팅 경로를 참조하는 드릴링 스타일 선택(“포인트별” 대 “수평”)을 프로그래밍할 수 있습니다. 처음에는 8 개의 “시드”지점이 뚫려 (그림 1A) 두개골 창을 설명합니다. 여기에서 씨앗 사이의 공간은 “점별” 또는 “수평” 드릴 방법을 사용하여 잘라냅니다. “Point-by-point”는 수직 파일럿 구멍 절단(CNC 드릴 프레스와 유사)을 수행하는 반면 “수평”은 구멍의 윤곽을 그리는 두개골 창 둘레를 따라 수평 절단을 수행합니다(CNC 라우터와 유사). 두 방법 모두 두개골 창을 드러내기 위해 제거할 수 있는 두개골 조각입니다. 드릴링으로 인한 손상을 분리하기 위해 두개골 창은 추가 손상을 방지하기 위해 물리적으로 제거되지 않습니다. 생쥐에서 개두술을 시행한 후 BBB 투과성을 측정하기 위해 형광 이미징과 결합된 EB 염료의 조합을 사용하고, 삽입된 열전대를 사용하여 드릴링 중 뇌 표면의 온도를 직접 측정합니다(그림 1B,C). 이전의 관찰은 2초 간격으로 펄스 드릴링 온/오프가 드릴 가열을 완화시키기에 충분하다는 것을 나타내었다⁽²⁵), 따라서 수술 로봇에 대한 실험적 접근법에 통합되었다.

제시된 작업의 목적은 개두술 드릴링으로 인한 열 손상을 평가하는 방법을 시연하는 것입니다. 방법은 자동 드릴링의 맥락에서 제시되지만 이러한 방법은 수동 드릴링 방식에도 적용될 수 있습니다. 이러한 방법은 표준 절차로 채택하기 전에 장비 및/또는 드릴링 계획의 사용을 검증하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1: 실험적 파이프라인 회로도. EB 정량화 후 두개골 창 절차를 위해 동물이 겪은 과정을 보여주는 개략도. (A) 정위 프레임과 수술 로봇 드릴을 사용한 마우스의 개략도 설정. 두개골 창의 예는 시드 포인트(녹색)와 가장자리 포인트(파란색)가 있는 운동 피질 위에 표시됩니다. (B) 관류 설정에는 동물 전체에 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 주입하여 혈액을 제거한 다음 뇌를 추출하는 것이 포함됩니다. (C) 그런 다음 뇌를 EB 형광 이미징 시스템 챔버에 넣어 Evans Blue 염료에 대한 형광 이미징을 수행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.