从成年非洲绿松石鳉鱼的脑组织中温和分离细胞核，这是一种自然短暂的衰老研究模型

动物护理和动物实验是根据南加州大学IACUC根据批准的协议#21215进行的。对于使用此协议的任何工作，在开始任何脊椎动物研究工作之前，必须获得该机构IACUC的批准。 注意：从快速冷冻的脑组织（从步骤3开始）开始的完整协议运行需要~2.5小时，对于六个样品（图1）。 1. 解剖鳉鱼大脑 在系统水中使用 1.5 g/L 甲磺酸盐/三卡因 （MS-222） 溶液人道地对鳉鱼实施安乐死。在所有身体和鳃运动停止后，使用锋利的剪刀迅速斩首鳉鱼。 如前所述，在干净的培养皿上解剖斩首的头19。将培养皿放在解剖显微镜下（使用8x-35x放大范围）。转动头部，使分支隐形射线聚焦 用剪刀剪开牙齿，露出分支鳐鱼和颅骨。 使用镊子按住颅骨两侧的分支鳐鱼。使用另一对镊子从颅骨中取出任何残留的组织碎片。连接大脑和眼睛的V形光学交叉应该变得可见。 用剪刀剪开视交叉，将双眼与大脑分离。用镊子轻轻地释放颅骨。 将颅骨倒置，用镊子从颅骨背侧刮下肌肉。 用一对镊子将颅骨固定到位，用另一对镊子轻轻取出颅骨，露出大脑。 大脑看起来又白又软。一旦可见，就不需要去除所有颅骨。用干净的镊子轻轻提起和刮擦去除大脑。 通过将大脑放入储存在干冰上的微量离心管中来快速冷冻大脑。注意：冷冻的脑组织可以储存在-80°C，直到收集所有要一起处理的样品，以限制处理文库生成时的批次效应。虽然储存在-80°C的样品不能无限期储存，但该方案已在储存长达12个月的鳉鱼大脑上成功执行，质量没有明显下降。 2. 准备新鲜的缓冲液 制备细胞核洗涤缓冲液（1x PBS 中的 2% 牛血清白蛋白 [BSA]、磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 0.2 U/μL RNase 抑制剂）并储存在冰上。为多达 8 个样品准备 250 mL 细胞核洗涤缓冲液。对于 250 mL，使用 50 mL 的 10% BSA 储备溶液、25 mL 的 10x PBS 储备溶液、1.25 mL 的 40 U/μL RNase 抑制剂储备液，然后使用不含 RNA 酶的 ddH2O 使体积达到 250 mL。 制备细胞核裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl 2、0.01875% v/v NP-40 和0.2 U/μL RNase 抑制剂）并储存在冰上。为多达 8 个样品准备 10 mL 细胞核裂解缓冲液。对于 10 mL，使用 100 μL 1 M Tris-HCl pH 7.4 储备溶液、20 μL 5 M NaCl 储备溶液、30 μL 1 M MgCl 2 储备溶液、18.75 μL 10% NP-40 储备溶液、50 μL 40 U/μL RNase 抑制剂储备液，然后用不含 RNA 酶的 ddH2O 使体积达到 10 mL。 3. 分离细胞核 如果使用冷冻样品，请在冰上解冻10分钟。如果使用新鲜解剖的大脑，请直接进入步骤3.2注意：虽然该协议可以适用于单个大脑，但来自幼鱼（5-6周龄）的较小样本的产量较差。无论鱼的年龄和性别如何，通过将两个大脑作为一个样本处理总是可以获得足够的产量（表1）。该方案已成功从5-26周龄的鱼类中分离出高质量的细胞核，包括来自GRZ和ZMZ1001菌株的动物。将此协议应用于其他菌株预计不会出现任何问题。 在 2 mL Dounce 匀浆器中的 1 mL 冰冷细胞核裂解缓冲液中弹跳大脑。将均质器保持在冰上，避免在裂解样品时产生气泡。以大约 0.5 秒/下冲程和 0.5 秒/上冲程的速度弹跳，每个周期扭转 180°。使用松散的杵弹跳15次，如果需要额外的笔划，则直到组织/裂解缓冲液混合物看起来均匀。注意：Dounce均质机应清洗，用蒸馏水冲洗，并在两次使用之间用标准干式高压灭菌器灭菌循环灭菌。用紧杵弹跳30次，每10次小休息30秒至1分钟。以大约 0.5 秒/下冲程和 0.5 秒/上冲程的速度弹跳，每个周期扭转 180°。让样品在Dounce均质机中的冰上休息2分钟。注意：此孵育时间可确保充分裂解，但如果观察到核过度裂解，则应缩短。 通过 70 μm 细胞过滤器将样品过滤到预涂有 5% BSA 的 15 mL 锥形管中。 将洗涤缓冲液移液到步骤3.3中的70μm细胞过滤器上，并通过倒置轻轻混合五次，向样品中加入4 mL细胞核洗涤缓冲液。注意：这允许回收可能被困在过滤器上的细胞核并提高产量。 使用水平吊桶转子在500× g，4°C下离心10分钟。轻轻倒入废液容器中，弃去上清液。将样品直立放回原位，并使用P1000移液器取出剩余的洗涤缓冲液。注意：从一个样本中的两个大脑开始时，细胞核沉淀可能是可见的。然而，当处理来自幼畜（5-6周龄）的单个大脑时，预计产量较低，并且颗粒可能并不总是可见。在这种情况下，应小心地除去上清液，同时假设沉淀在管底部的位置。 立即用宽口径 P1000 移液器吸头将细胞核重悬于 1 mL 细胞核洗涤缓冲液中。 加入 4 mL 细胞核洗涤缓冲液，将样品调至 5 mL，并通过倒置轻轻混合 5 次。使用摆动桶转子在500× g，4°C下离心10分钟，并弃去上清液。 用宽口径移液器吸头将细胞核重悬于 1 mL 细胞核洗涤缓冲液中，并转移到流式细胞术 （FACS） 管中。 加入 300 μL 碎屑去除溶液（材料表），用宽口径吸头移液彻底混合，直到混合物均匀。 使用 P1000 移液管将 1 mL 细胞核洗涤缓冲液轻轻覆盖在步骤 3.9 中制备的细胞核溶液的顶部，并以轻微的角度保持试管（补充图 2）。如果分层正确，碎片去除溶液馏分和细胞核洗涤缓冲液馏分应形成清晰的界面。 在水平桶转子中以3000× g，4°C离心10分钟。使用 P1000 移液器完全丢弃前两相。注意：透明的FACS管将允许离心后三个不同相的可视化（顶部，中间相，底部）。为了便于最大限度地清除碎屑，建议在去除前两相时比保守更积极（即，去除少量的底部相比延续任何顶部相更可取; 补充图2）。此外，界面层可能太薄而无法可视化。在这种情况下，请去除包含相间层的顶部（表观）层。保留的底层应包含 ~1 mL 的总体积。 将底层转移到预涂有 5% BSA 的 15 mL 锥形管中。 在锥形管中，用细胞核洗涤缓冲液将体积降至 15 mL，并倒置 3 次以混合。 在水平桶转子中以1000× g，4°C离心10分钟。小心地取出上清液。 立即使用宽口径移液器吸头重悬于 150 μL 细胞核洗涤缓冲液中。 切换到设置为 ~300 μL 的标准孔径移液器吸头。 摄取整个样品，然后将 40 μm 吸头过滤器连接到移液器吸头的末端，注意不要排出样品。注意：尖端过滤器是获得较小体积所必需的，这是为下游应用保持足够的细胞核浓度所必需的。例如，对于使用微流体的snRNA-seq，建议最低浓度为>300个细胞核/μL，尽管最佳范围为700-1200个细胞核/μL18。如有必要，也可以轻松稀释更高浓度的细胞核。 通过将样品通过过滤器强行排出到低 DNA 结合的 1.5 mL 微量离心管中来过滤样品。最终洗脱体积应为120-150 μL。注意：过滤可能会导致一些起泡。这似乎不会影响细胞核质量。 4. 通过显微镜评估细胞核质量 在单独的微量离心管中，轻轻移液将 10 μL 过滤样品与 10 μL 0.4% 台盼蓝溶液混合。样品无需延长孵育时间，与台盼蓝溶液混合后即可立即进行可视化。 将 10 μL 染色的细胞核沉积到计数室载玻片的腔室中。注意：或者，将 10 μL 染色的细胞核样品沉积到血细胞计数器或显微镜载玻片上，并盖上盖玻片。 通过光学显微镜评估细胞核质量。注意：较低的放大倍率只能用于放大细胞核，因为细胞核缺陷只有在较高放大倍率（即60倍或更高）下才会在视觉上明显。此步骤可以快速完成，以评估细胞核制备的成功，并且不需要目视检查以外的二次分析。高质量、完整的细胞核将具有清晰定义的边界20 （图2A）。质量差的细胞核会破坏核膜，核膜附近的斑片状台盼蓝染色表明潜在的核酸泄漏，和/或起泡的证据20 （图2B）。健康的细胞核直径预计为10-15μm。 5. 通过流式细胞术定量单线态细胞核、碎片和多重比例 注意：流式细胞仪软件的具体术语和界面可能因机器品牌而异，但如果需要，这些步骤应易于适应其他系统。 在 FACS 管中，将 10 μL 过滤后的细胞核样品重悬于推荐用于流式细胞术的 90 μL 缓冲液中，以 1：10 稀释。为此，本研究使用0.22μm过滤灭菌PBS，pH 7.2，含2mM EDTA和0.5%BSA。注意：虽然这种稀释适用于大多数细胞核制备，但在产量较低的样品（即稀释样品中<30个细胞核/μL）的情况下，可能需要较低的稀释度（例如，1：5）来采样足够的细胞核以进行质量评估。 用碘化丙啶（PI）对样品进行染色，终浓度为1μg/ mL。无需孵育时间，可立即分析细胞核。注意：或者，用终浓度为 0.1 μg/mL DAPI 对样品进行染色。请注意，DAPI应在与PI不同的荧光通道上读取（Vioblue-A V1-A通道;激发在405 nm处，发射在450/50 nm处）。 在流式细胞仪上分析样品，如下所示：设置工作区：将流式细胞仪置于采集模式。单击“ 文件”，然后从下拉菜单中选择 “新建工作区 ”。在左侧面板的“ 试验 ”选项卡下，在各自的字段中输入 “项目名称 ”和 “示例 ID ”。 在左上角工具栏中，单击 “新建分析窗口 ”按钮（散点图图标）。从弹出菜单中单击包含三个图的框（绘图 4t）。屏幕上将出现三个图。单击左上角工具栏中的 “分析模式 ”按钮（A 图标），使其显示为灰色而不是橙色。 设置分析图：更改三个图的轴，如下所示，分别按 X 轴和 Y 轴排序：图 1： X 轴：FSC-A， Y 轴：SSC-A图 2： X 轴：HDR-T， Y 轴：SSC-A图 3： X 轴：PerCP-Vio700-A B3-A， Y 轴：SSC-A 通过单击轴标签并从下拉菜单中选择所需的通道来更改 轴 。 通过单击每个图右上角旁边显示的方形灰色“i”图标，将图设置为密度颜色编码。将打开“ 属性 ”窗口，左侧显示一组按钮。在 “属性 ”窗口中，单击“ 散点图 ”图标（面板左侧顶部的第二个图标）。单击 确定。注意：PerCP-Vio700-A B3-A 荧光通道对应于 488 nm 处的激发，以及 650-730 nm 范围内的发射。 设置仪器设置：单击左侧面板中的 频道 选项卡。将显示所有频道的列表，右侧有三个框。将 B3、FSC-A 和 SSC-A 设置为 Hlog，方法是单击右侧相应第一个框中的向下箭头，然后从下拉菜单中选择 Hlog 。 将 SSC 的电压设置为 640 V，将 FSC 设置为 300 V，将 B3 设置为 480 V，方法是在右侧各自的中间框中键入这些数字，然后按 Enter 键。请注意，右侧的第三个框是一个切换开关，可以交替用于键入。 在 “触发器 ”标题下，将 FSC 触发器设置为 4，将 SSC 和 B3 触发器设置为 0，方法是单击向下箭头，从左侧的下拉菜单中选择它们，在右侧的框中键入数字，然后按 Enter 键。请注意，右侧有一个切换框，可以替代键入。注意：PMT电压需要针对每台特定的流式细胞仪进行优化，但细胞核的触发必须低于通常用于细胞的触发电压。此外，轴刻度应设置为 h 对数。 在 样品 体积文本框中输入 100 μL，在流程软件窗口左侧的 摄取体积 文本框中输入 50 μL。验证 混合样品 参数是否设置为混合 温和 ，以避免在此步骤中裂解细胞核。按右下角圆圈内的三角形（播放 图标）开始流动。 验证流量质量：使用侧向散射区域 （SSC-A） 与 HDR-T 检查样品中的气泡或团块。确保此图是点的平滑连续体。气泡或团块将导致SSC-A与HDR-T图中的空白区域。 检查侧向散射（SSC-A）与前向散射（FSC-A）图，以验证所用电压对样品是否正确。注意：与细胞不同，细胞核不会完全从侧向散射与前向散射图中的碎片中分离出来。但是，在对应于原子核（较暖的颜色）的图的中间应该有一个高密度的事件簇，而对应于碎片的背景中应有较低密度的事件（较冷的颜色）。 分析细胞核计数和质量：双击 SSC-A 与 PerCp-Vio-700A 图 可查看放大视图。单击左上角工具栏上带有垂直线（象限）的按钮以选择象限门。然后，单击 SSC-A与PerCp-Vio-700A 图中的任意位置，象限将出现在图中。 单击象限分隔线上的任意位置，然后滑动光标以修改象限位置。放置象限，使左上象限包含最左侧的群体（碎片），右上象限包含几个泪滴形簇（核）（有关浇口设置和流动结果示例，请参阅 图3 ，以获取包括或不包括碎片清除步骤的制备的典型结果）。 碎片与细胞核计数：单击绘图右上角的方形灰色“i”图标以打开 “属性 ”窗口。单击 区域功能 选项卡;将出现绘图区域和功能的列表。 在 “区域” 列表下，确保顶部项目旁边有一个绿色复选标记，表示已选择整个绘图。在 “功能 ”列表下，单击 “计数/μL ”以生成绿色复选标记。单击“ 确定”，每个象限中将显示一个计数/μL 指标。 要查看原始计数和百分比，请根据需要从“区域函数”选项卡中选择“计数和 %-T”。左上象限和右象限的计数/μL分别对应于碎片和细胞核产量。 单线态计数：右上象限下部最左边的泪滴形簇代表单线。通过单击左上角工具栏上的多边形按钮 （Polygon） 在此人口周围绘制面门。 单击一次，滑动鼠标开始绘制，然后再次单击以完成门的线性段并开始下一个。双击以完成门。单击门的边框，然后滑动鼠标以重新定位门。 单击门的顶点以修改形状。将出现门控群体（单线管）的计数/μL。这是初始稀释液中细胞核制备的浓度。注意：前向散射面积与高度 1：1 线性关系，通常用于确定流动细胞时的单重态速率，不适用于细胞核，可以忽略不计。 使用稀释的细胞核制备物的浓度和稀释因子，反向计算初始制备的浓度（例如，对于1：10的稀释度，将观察到的浓度乘以10）。浓度从 >300 个细胞核/μL 开始适用于 snRNA-seq。