Anjiyotensin II İndüklü Abdominal Aort Anevrizmasının Bir Fare Modelinde Santral Venöz Kateter ile İlaç Tedavisi ve 3D Ultrason ile İzleme
Summary
Bu protokol, apolipoprotein E (ApoE) eksikliği olan farelerde anjiyotensin II salınımı ile abdominal aort anevrizmasını indüklemek için ozmotik bir pompanın ve tekrarlanan ilaç tedavisi için juguler ven kateterli bir vasküler erişim portunun ardışık implantasyonunu tanımlar. Anevrizma gelişiminin 3D ultrason ile izlenmesi, dorsal implantlara rağmen etkili bir şekilde gerçekleştirilir.
Abstract
Abdominal aort anevrizmasının (AAA) klinik yönetiminde farmasötik tedavi seçenekleri bulunmadığından, hastalık patogenezinin anlaşılmasını ilerletmek ve potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için hayvan modelleri, özellikle fare modelleri uygulanmaktadır. Bu modellerde AAA büyümesini engellemek için yeni ilaç adaylarının test edilmesi, genellikle deneyin süresi boyunca tekrarlanan ilaç uygulamasını gerektirir. Burada, AAA indüksiyonu, uzun süreli tedaviyi kolaylaştırmak için intravenöz kateter yerleştirilmesi ve 3D ultrason ile seri AAA monitörizasyonu için derlenmiş bir protokol açıklanmaktadır. Anevrizmalar, apolipoprotein E (ApoE) eksikliği olan farelerde, deri altından farenin arkasına implante edilen ozmotik mini pompalardan 28 gün boyunca anjiyotensin II salınımı ile indüklenir. Daha sonra, eksternal juguler ven kateterizasyonu için cerrahi prosedür, günlük intravenöz ilaç tedavisine veya bir subkutan vasküler erişim düğmesi aracılığıyla tekrarlanan kan örneklemesine izin vermek için gerçekleştirilir. İki dorsal implanta rağmen, AAA gelişiminin izlenmesi, deneysel örneklerde gösterildiği gibi, aort çapının ve hacminin genişlemesi ve anevrizma morfolojisi hakkında kapsamlı bilgi veren sıralı yarı otomatik 3D ultrason analizi ile kolayca kolaylaştırılmıştır.
Introduction
Abdominal aort anevrizması (AAA), aort duvarındaki enflamatuar ve doku-yıkıcı süreçlere bağlı olarak bir damarın patolojik dilatasyonudur ve sonuçta rüptür ve hasta ölümüne yol açabilir. Cerrahi AAA onarımında önemli başarılara rağmen, anevrizma genişlemesinin ilerlemesini engellemek ve potansiyel olarak rüptür riskini azaltmak için konservatif bir ilaç tedavisi bugüne kadar eksiktir. Hastalığın tetikleyicilerini ve aracılarını aydınlatmak ve tedaviye yeni yaklaşımları test etmek için hayvan modelleri geliştirilmiştir. AAA’nın fare modelleri yaygın olarak uygulanır ve insan dokusundan farklı gözlemleri kapsar. Pathomechanistic farklılıkları nedeniyle, moleküllerin / yolakların özel işlevini veya potansiyel terapötik ilaçların etkinliğini araştırmak için genellikle birden fazla model uygulanır 1,2. AAA indüksiyonunun en sık kullanılan modelleri arasında, akut bir hakaretten aort duvarına kadar anevrizma oluşumuna dayanan modellere kıyasla daha kronik benzeri patogeneze sahip olan apolipoprotein E eksikliği (ApoE KO) farelerde anjiyotensin-II (Ang-II) uygulaması 3,5’tir. Bu nedenle, Ang-II modeli hastalığın ilerlemesini izlemek için özellikle uygun görünmektedir ve son zamanlarda metabolik ve enflamatuar yanıtlar açısından insan AAA hastalığına yakından benzediği gösterilmiştir6. Özellikle, Ang-II modelinde sadece AAA gelişimi değil, aynı zamanda torasik anevrizma oluşumu ve intramural trombüs oluşumu ile aort diseksiyonu da bulunmaktadır.
Hastalığın başlamasını önlemek yerine, halihazırda yerleşmiş AAA’nın ilerlemesini hedeflemeyi amaçlayan tedaviler, tedavi gerektiren önceden var olan bir durumla başvuran hastalar olarak daha yüksek translasyonel değere sahip olabilir 7,8. Karşılaştırılabilir bir deneysel tasarım için, hastalık gelişiminin bir eşiğini tanımlamak ve potansiyel olarak fareleri tedavi gruplarına sınıflandırmak için AAA indüksiyonundan önce ve sonra aort boyutunun izlenmesi gerekir.
İlaç uygulama şekli, ilgili maddenin alımına ve stabilitesine bağlıdır. İntraperitoneal (i.p.) enjeksiyonlar en sık uygulama kolaylığı, anestezi gerektirmemesi ve enjeksiyon hacmi kısıtlamalarının olmaması nedeniyle kullanılır9. Bununla birlikte, uygulama yolunu seçerken farmakokinetiği göz önünde bulundurulmalıdır, çünkü i.p. uygulanan maddeler öncelikle hepatik portal dolaşım yoluyla emilir ve dolaşıma ulaşmadan önce karaciğer metabolizmasına uğrayabilir, bu da ilk geçiş etkisine bağlı olarak değişen plazma konsantrasyonlarına neden olabilir10. İntravenöz (i.v.) enjeksiyon, maddelerin en yüksek biyoyararlanımını sağlar ve tekrarlayan i.v. erişiminin zorluğu, günlük uygulama için kateterlerin ve vasküler erişim portlarının kullanılmasıyla atlatılabilir11,12,13. AAA ayarı ile ilgili olarak, dolaşımdaki ilaç dağılımı, tanımlanmış konsantrasyonlarda doğrudan anevrizma maruziyetini kolaylaştırır.
Burada, Ang-II fare modelinde AAA’yı bir ozmotik pompanın deri altı implantasyonu yoluyla indüklemek, harici juguler ven içine yerleştirilen bir katetere bağlı bir vasküler erişim portu aracılığıyla günlük i.v. ilaç tedavisi ve iki dorsal implantın varlığına rağmen 3D ultrason14 ile anevrizma boyutunun izlenmesi için bir iş akışını açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ang-II modeli, düşük teknik talepleri ve insan hastalığına benzeyen özel özellikleri nedeniyle AAA’nın en yaygın kullanılan fare modellerinden biridir 3,6. Ameliyat süresi hayvan başına yaklaşık 10 dakikadır ve deri altı cebi yeterince genişse ve hayvanın sırtında, insizyon bölgesinden uzakta, yara iyileşmesine müdahale etmeyecek şekilde alçak yerleştirilmişse, deri altı pompa implantasyonu fareler tarafından iyi tolere edilir. Cilt pompanın etrafında sıkı olduğunda, doku tahrişi meydana gelebilir, bu da iltihaplanmaya ve kabuklanmaya neden olabilir ve potansiyel olarak pompanın ozmotik basınçla serbest bırakma mekanizmasını bozabilir. Hayvan kurbanı sırasında pompada kalan Ang-II’nin hacminin ölçülmesi, Ang-II’nin 28 gün boyunca başarılı bir şekilde serbest bırakılıp bırakılmadığı konusunda fikir verir.
Ang-II modelinin son zamanlarda aort anevrizmasını ve diseksiyon ilerlemesini incelemek için çok uygun olduğu öne sürülmüştür, çünkü her iki6’nın insan özellikleriyle benzerlik göstermektedir. Daha da önemlisi, aort genişlemesini engellemek ve yeniden şekillenmeyi etkilemek için ilaç adaylarının test edilmesi, mevcut klinik talebe uygun olacaktır. Deneysel ortamımızda, tedaviye başlamadan önce, farelerde mutlak aort boyutundaki doğal değişimi açıklayan başlangıç çizgisine göre% 125 hacim büyümesine dayanarak, anevrizma oluşumu için bir kesim tanımlanmıştır. Eşik ve zaman noktası, histolojide aort duvarı yıkımını doğrulayan (veriler gösterilmemiştir) ve kateter implantasyonundan önce% 35 rüptür ve% 56 gözlenen AAA’larla sonuçlanan bir başlangıç zaman seyrinden türetilmiştir. Çalışmaya dahil edilmek üzere minimum bir belirlenmiş hastalık eşiği uygulanırken, daha sonra yüksek oranda başlangıç aort genişlemesinin deneysel uygulanabilirliği de sınırlayabileceği gözlenmiştir. 8. günde hızla %>200 hacme ulaşan anevrizmalar, olguların %55’inde bu boyutun üzerine çıkmamıştır (Şekil 1D). Bu, deneysel tasarım ve örneklem büyüklüğü hesaplaması sırasında dikkate alınmalıdır, çünkü bir tedavinin gerçek etkisini maskeleyebilir. Bu modelin bir başka yönü de% 20-40 oranlarında ve çoğunlukla Ang-II pompaimplantasyonundan sonraki ilk 10 gün içinde meydana gelen sık aort rüptürleridir (torasik veya karın). Böylece, tedavinin başlangıcını 9. gün olarak seçerek, yüksek oranda yerleşik anevrizmalar elde edildi ve juguler ven kateterizasyonu esasen deneyin sonuna kadar hayatta kalması beklenen farelerde gerçekleştirildi (tarihi kontrol grubumuzda sadece 3/24 fareler 9. günden sonra yırtıldı), böylece zaman, çaba korundu, ve maliyet.
Ciddi bir durum oluşturan aort rüptürlerinin yanı sıra, kateterin vasküler erişim düğmesi ve ozmotik pompa ile eşzamanlı implantasyonu, fareler tarafından iyi tolere edildi ve ameliyattan sonra iyileşme sonrası hareketlilik veya davranış üzerinde kayda değer bir etkisi olmadı. Juguler ven kateterizasyon prosedürü eğitimli araştırmacılar için yaklaşık 30 dakika sürmelidir. (İzofluran) anesteziye maruz kalma süresi minimumda tutulmalı ve solunum depresyonunu önlemek için hayvan solunum hızı yakından izlenmelidir, bu da çözülmediği takdirde ölümcül bir sonuca yol açabilir20. Kateter yerleştirilmesi için juguler veni deldikten sonra kan kaybı – majör ise hayvan ölümüne yol açar – juguler ven kraniyal olarak düzgün bir şekilde bağlanmadığında veya damarın izole bölgesine beslenen bir yan dal kapatılmadığında potansiyel olarak ortaya çıkabilir. Bu durumda, kan sızıntısı yavaşlayana veya durana kadar delinme bölgesine pamuklu çubukla basınç uygulanmalı, daha sonra kateter yerleştirme ve ligasyon mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır; Kollajen yara örtüsünün küçük bir parçası hemostaza yardımcı olmak için geçici olarak kullanılabilir.
Kateter açıklığı en önemli faktörlerden biridir, çünkü kateter damardan veya erişim düğmesinden kopması, ilacın deri altı boşluğuna sızdığı yerlerde yanlış ilaç verilmesine neden olur. Üreticinin kateter ve metal bağlayıcı arasında en az 3 mm örtüşme önerisi üzerine, yaranın açılması ve ameliyatta bağlantının yeniden kurulmasıyla sabitlenen bu modelde (2020-2021, n=73) 3 yıl boyunca düğme tarafında sadece bir kateter kopması vakası (düğmedeki kesi yerinden sızan enjekte sıvı ile gösterilir) kaydedilmiştir. Ek olarak, tarihsel PBS kontrol grubumuzda (2/21) kateter tıkanıklığı (enjekte etmeyi imkansız hale getiren), damardan kateter bağlantısının kesilmesi (enjeksiyon sırasında boyunda belirgin şişlik ile belirtilir) veya yara iyileşmesi komplikasyonları nedeniyle yaklaşık %10’luk bir kateter açıklığı başarısızlığı oranı yaşanmıştır. Bu sorunlar, kendi kendine meydana gelen yaralanmalara, yani fare çiziklerine veya ısırıklarına bağlı olabilir. Özellikle, yara iyileşmesine müdahale eden ilaç tedavileri başarısızlık oranlarını artırabilir. Açıklık oranını iyileştirmek için sorun giderme adımları, damara yerleştirilen kateterin uzunluğunun arttırılmasını, ligatürlerin kateter ve ven etrafında sıkıca düğümlenmesini sağlamayı ve enjekte ederken adım 2.12.10.’da açıklandığı gibi üreticinin tavsiyesine uygun olarak pozitif basınç tekniğini uygulamayı içerir. Kateter açıklığı ayrıca hayvan kurban edilirken mikroskop altında diseksiyon ve görsel muayene ile doğrulanmalıdır. Not olarak, enjekte edilen ilaç çözeltisinin günlük hacmi dikkatlice düşünülmelidir. Plazma hacmi kan basıncını düzenlediğinden, enjeksiyon hacmi AAA genişlemesini etkileyebilir ve bu nedenle kontrol hayvanlarının taşıyıcı hacimli sahte prosedürü almaları gerekir. Deneyimlerimize (ve yayınlanmamış gözlemlere) dayanarak, günlük 250 μL’ye kadar PBS miktarı iyi tolere ediliyor gibi görünmektedir. Son olarak, pompa implantasyonuna benzer şekilde, implante edilen vasküler erişim düğmesinin etrafında cilt tahrişi meydana gelebilir. Devitalize veya nekrotik dokunun eşlik ettiği iltihaplanma gözlenirse, canlı olmayan doku çıkarılarak yara debridmanı yapılmalıdır (nekrotik doku genellikle yaradan doğal olarak ayrılacaktır) ve gerekirse cilt dikilmelidir; Enflamasyon ve nekroz yaygınsa, hayvanın refahı ve insancıl bitiş noktaları kılavuzlara göre düşünülmelidir.
Ozmotik pompanın ve/veya VAS’ın tek ve çift dorsal implantasyonu, ultrason sinyaline veya farenin ultrason aşamasında uygun bir pozisyonda sabitlenmesine müdahale etmedi. Hacim ölçümü için aortun 3D görüntüsünü oluşturmak üzere 12 mm’nin üzerinde 157 karenin otomatik olarak elde edilmesi, yalnızca aortun ilgi alanı üzerindeki parazitten arındırılmasını sağlayan basit ve hızlı bir prosedürdür14. Bu bağlamdaki bir tuzak, girişim görüntüsünü temizlemeye çalışırken dönüştürücü ile çok fazla basınç uygulamaktır; bu, abdominal aortun kraniyal ucunun görüntüleri kaydedildiğinde solunum hızı kaburgaların sıkışmasından etkilenirse otomatik ölçümü kesintiye uğratabilir. Çap geleneksel olarak, ultrason analizi yapılırken maksimum çap alanını manuel olarak arayan operatör tarafından B modu kullanılarak elde edilen görüntülerde ölçülür. B modu görüntülerindeki bir gelişme, titreşen aortun yüksek kaliteli, yavaşlatılmış bir görüntüsünü üretmek için küçük aort hareketlerini çözebilen EKV görüntüleridir. Ayrıca, maksimum aort çapı, 157 görüntünün sistolde alınan aortun kapsamlı bir genel bakışını sunduğu (ayarlanmış EKG tetikleyicisi nedeniyle) elde edilen 3D çerçevelerden belirlenebilir.
Sonuç olarak, sunulan derlenmiş protokol, Ang-II ile indüklenen AAA’nın bir fare modelinde i.v. ilaç uygulaması ve 3D ultrason ile aort boyutunun izlenmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar. İzleme ve operasyon zaman noktaları özel ihtiyaçlara göre ayarlanabilir ve juguler ven kateterizasyonu, i.v. enjeksiyonları yoluyla spesifik maddelerin verilmesini gerektiren herhangi bir deney düzeni için ayrı ayrı gerçekleştirilebilir. VAS, pıhtılaşmayı önlemek için bir kateter kilit çözeltisi kullanılıyorsa, alternatif olarak tekrarlanan kan örneklemesi için kullanılabilir. Tarif edilen 3D ultrason prosedürü, AAA’nın elastaz veya CaCl2 tabanlı fare modellerinde akut hakaret üzerine anevrizmaların geliştiği infrarenal aortu ölçmek için uyarlanabilir. 3D ultrason edinimi, etkilenen aort bölgesi ve anevrizma morfolojisine genel bir bakış sunma avantajına sahip olsa da, görüntü alımı daha zaman alıcıdır ve bu nedenle daha maliyet yoğun olabilir. Protokolün kabul edilmesi gereken bir diğer sınırlaması, intravenöz enjeksiyonlar için hayvanların kısaca anestezi altına alınması ihtiyacıdır, intraperitoneal uygulama genellikle bilinçli farelerde yapılır.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hayvan deneylerindeki yardımları için Prof. Podesser ve Prof. Ellmeier’in ekiplerine (Biyomedikal Araştırma Bölümü ve Laboratuvar Hayvanları Yetiştiriciliği ve Yetiştiriciliği için Temel Tesis, Viyana Tıp Üniversitesi) teşekkür ederiz. AAA trikrom boyaması, Monika Weiss ve Prof. Peter Petzelbauer (Viyana Tıp Üniversitesi Dermatoloji Bölümü) tarafından nazikçe gerçekleştirildi. Bu çalışma Avusturya Bilim Fonu [SFB projesi F 5409-B21] tarafından desteklenmiştir. Marc Bailey, İngiliz Kalp Vakfı [FS/18/12/33270] tarafından kişisel olarak desteklenmektedir.
Materials
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
Referências
- Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS-Vascular Science. 2, 219-234 (2021).
- Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. British Journal of Pharmacology. 179 (5), 792-810 (2022).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
- Phillips, E. H., et al. Morphological and biomechanical differences in the elastase and AngII apoE -/- rodent models of abdominal aortic aneurysms. BioMed Research International. 2015, 413189 (2015).
- Gäbel, G., et al. Parallel murine and human aortic wall genomics reveals metabolic reprogramming as key driver of abdominal aortic aneurysm progression. Journal of the American Heart Association. 10 (17), 20231 (2021).
- Phie, J., Thanigaimani, S., Golledge, J. Systematic review and meta-analysis of interventions to slow progression of abdominal aortic aneurysm in mouse models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1504-1517 (2021).
- Lu, H. S., Owens, A. P., Liu, B., Daugherty, A. Illuminating the importance of studying interventions on the propagation phase of experimental mouse abdominal aortic aneurysms. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1518-1520 (2021).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: Should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Research. 37 (1), 1-17 (2020).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Derde, S., et al. Use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness. Journal of Visualized Experiments. (123), e55553 (2017).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Waduud, M. A., et al. High-frequency three-dimensional lumen volume ultrasound is a sensitive method to detect early aneurysmal change in elastase-induced murine abdominal aortic aneurysm. Aorta. 9 (6), 215-220 (2020).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013 (2019).
- Eilenberg, W., et al. Histone citrullination as a novel biomarker and target to inhibit progression of abdominal aortic aneurysms. Translational Research. 233, 32-46 (2021).
- Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (9), 1621-1626 (2003).
- Trachet, B., Fraga-Silva, R. A., Jacquet, P. A., Stergiopulos, N., Segers, P. Incidence, severity, mortality, and confounding factors for dissecting AAA detection in angiotensin II-infused mice: A meta-analysis. Cardiovascular Research. 108 (1), 159-170 (2015).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Laboratory Animals. 44 (4), 329-336 (2010).
