La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas
Summary
La técnica peel-blot es un método de preparación de rejilla crio-EM que permite la separación de muestras biológicas concentradas y de múltiples capas en capas individuales para reducir el espesor, aumentar la concentración de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes.
Abstract
La técnica de preparación de rejilla crio-EM peel-blot es un método de retroinyección significativamente modificado con el objetivo de lograr una reducción en las capas de muestras de múltiples capas. Esta eliminación de capas antes de la congelación por inmersión puede ayudar a reducir el grosor de la muestra a un nivel adecuado para la recopilación de datos crio-EM, mejorar la planitud de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes. La técnica peel-blot permite la separación de membranas multilamelares en capas individuales, de cristales 2D en capas en cristales individuales, y de estructuras apiladas, en forma de lámina, de proteínas solubles que también se separan en capas individuales. El alto espesor de muestra de este tipo de muestras con frecuencia plantea problemas insuperables para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes crio-EM, especialmente cuando la etapa del microscopio debe inclinarse para la recopilación de datos. Además, se pueden preparar rejillas de altas concentraciones de cualquiera de estas muestras para una recopilación de datos eficiente, ya que la concentración de la muestra antes de la preparación de la rejilla se puede aumentar y ajustar la técnica de peel-blot para dar como resultado una distribución densa de muestras de una sola capa.
Introduction
La técnica peel-blot se desarrolló con el fin de separar cristales bidimensionales apilados de proteínas de membrana en capas individuales para obtener muestras adecuadamente delgadas para la recolección de datos crio-EM 2D y 3D y facilitar el procesamiento de imágenes1. El protocolo es igualmente adecuado para otros tipos de muestras multilaminares, así como para lograr altas concentraciones de muestra de cualquier tipo de muestra en la rejilla sin aumentar el grosor en Z.
La reducción de las capas de muestra a una capa se logra aplicando una combinación de presión capilar y fuerzas de cizallamiento en un protocolo que amplía sustancialmente y modifica el método de inyección posterior2. Un primer paso de secado da como resultado un sándwich apretado y adherencia a la película de carbono y una barra de rejilla a cada lado de la muestra de varias capas durante la secado en submicrónico en lugar del tamaño de poro del papel de filtro de 20-25 μm en el método de inyección posterior. La separación, o pelado, de una capa individual ocurre al forzar la separación de las capas intercaladas una vez que la rejilla se presiona verticalmente sobre una gota de trehalosa, forzando la película de carbono lejos de la barra de rejilla (Figura 1). El reposicionamiento de la película de carbono lejos del punto de contacto original con la barra de rejilla se produce en el siguiente paso, cuando la rejilla se borra una vez más en papel de filtro submicrónico. El número de iteraciones de estos pasos se puede optimizar para muestras específicas. Además, el protocolo se puede utilizar para aumentar las concentraciones de la muestra evitando la agregación en Z. Debido a la dependencia de la adherencia a la barra de rejilla y la película de carbono, así como a la separación forzada, este enfoque puede no ser adecuado para moléculas altamente frágiles como ciertas proteínas delicadas y / o inestables y complejos de proteínas.
La técnica peel-blot no requiere equipo especializado ni suministros costosos. Sin embargo, la aplicabilidad a muestras específicas requerirá consideraciones cuidadosas de los parámetros biológicos. La decisión es más fácil para los cristales 2D, ya que se requiere una película de carbono para garantizar la planitud, pero la manipulación a través de la técnica peel-blot puede afectar la integridad biológica de la muestra o el orden cristalino. La idoneidad de la técnica peel-blot para partículas individuales está restringida y puede probarse para aquellas que requieren película de carbono y son estables a la manipulación. Los especímenes con interacciones biológicas críticas entre capas pueden no ser adecuados para la caracterización con la ayuda de la técnica peel-blot debido a la interrupción de tales interacciones.
La técnica peel-blot (“peel-blot”) se optimiza más rápidamente mediante pruebas y cribado con tinción negativa o muestras no teñidas por TEM a temperatura ambiente. Una vez que se ha identificado el número óptimo de iteraciones de peel-blot, se puede determinar el tiempo para controlar el grosor antes de la vitrificación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El peel-blot es un método poderoso para superar el apilamiento y el grosor de cristales 2D de múltiples capas y muestras similares para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes. La decisión sobre el uso del peel-blot se basará en los parámetros biológicos de la muestra y también requerirá una evaluación una vez que esté disponible un modelo 3D crio-EM. La importancia biológica de los contactos y la flexibilidad potencial de las regiones de contacto serán particularmente importantes en…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parte de este trabajo fue apoyado por la subvención HL090630 (ISK) de los NIH.
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
Referências
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
