剥离印迹技术：一种冷冻电镜样品制备方法，用于从多层或浓缩生物样品中分离单层
Summary
剥离-印迹技术是一种冷冻电镜网格制备方法，可将多层和浓缩的生物样品分离成单层，以减小厚度、提高样品浓度并促进图像处理。
Abstract
剥离印迹冷冻电镜网格制备技术是一种经过显著修改的背进样方法，目的是减少多层样品的层数。在冷冻之前去除层有助于将样品厚度降低到适合冷冻电镜数据收集的水平，提高样品平坦度并促进图像处理。剥离-印迹技术允许将多层膜分离成单层，将分层的2D晶体分离成单个晶体，并将可溶性蛋白质的堆叠片状结构分离成单层。这些类型样品的高样品厚度经常给冷冻电镜数据收集和冷冻电镜图像处理带来无法克服的问题，特别是当显微镜载物台必须倾斜以进行数据收集时。此外，可以制备高浓度的这些样品的网格以进行有效的数据收集，因为可以增加网格制备之前的样品浓度，并且可以调整剥离印迹技术以产生单层样品的密集分布。
Introduction
开发剥离印迹技术是为了将堆叠的膜蛋白二维晶体分离成单层，以获得用于冷冻电镜 2D 和 3D 数据收集的适当薄样品，并促进图像处理1.该方案同样适用于其他类型的多层样品，以及在不增加Z厚度的情况下在网格上实现任一样品类型的高样品浓度。
通过在协议中施加毛细管压力和剪切力的组合，将样品层减少到一层，该方案大大扩展并修改了背注方法2。第一个印迹步骤导致紧密夹层，并在亚微米（而不是背面进样方法中的20-25μm滤纸孔径）上粘附在多层样品两侧的碳膜和网格条上。一旦将网格垂直压在海藻糖液滴上，迫使碳膜远离网格条，就会发生单个层的分离或剥离，从而迫使夹层分离（图 1）。在下一步中，当网格再次印迹在亚微米滤纸上时，碳膜将远离与网格条的原始接触点重新定位。这些步骤的迭代次数可以针对特定样本进行优化。此外，该方案可用于增加样品浓度，同时避免聚集在Z中。 由于依赖于对网格条和碳膜的粘附以及强制分离，这种方法可能不适用于高度脆弱的分子，例如某些脆弱和/或不稳定的蛋白质和蛋白质复合物。
剥离印迹技术既不需要专门的设备，也不需要昂贵的耗材。然而，对特定样品的适用性需要仔细考虑生物参数。对于2D晶体来说，这个决定更容易，因为需要碳膜来确保平整度，但通过剥离印迹技术 进行操作 可能会影响样品或晶体顺序的生物完整性。剥离印迹技术对单个颗粒的适用性仅限于需要碳膜且对操作稳定的颗粒，并且可以对其进行测试。层间具有关键生物相互作用的标本可能不适合借助剥离-印迹技术进行表征，因为这种相互作用会中断。
剥离-印迹技术（“剥离-印迹”）通过在室温下通过 TEM 对阴性染色或未染色样品进行测试和筛选来最快速地优化。一旦确定了最佳的剥离-印迹迭代次数，就可以确定玻璃化前控制厚度的时间。
Protocol
Representative Results
Discussion
剥离印迹是一种强大的方法，可以克服多层二维晶体和类似样品的堆叠和厚度，以进行冷冻电镜数据收集和图像处理。关于使用剥离印迹的决定将基于样品的生物学参数，一旦3D冷冻电镜模型可用，也需要进行评估。接触的生物学重要性和接触区域的潜在灵活性在这项评估中尤为重要。
剥离印迹的数量最初将在标准阴性染色网格制备后通过观察 确定 ，其中过多的层或?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作的一部分得到了NIH资助HL090630（ISK）的支持。
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
Referências
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
