Este protocolo descreve métodos para a realização de ressonância magnética, limpeza e imunomarcação de cérebros de camundongos intactos usando iDISCO+, seguido por uma descrição detalhada de imagens usando microscopia de folha de luz e análises a jusante usando NuMorph.
A limpeza tecidual seguida de microscopia de folha de luz (LSFM) permite a imagem de resolução celular da estrutura cerebral intacta, permitindo a análise quantitativa de mudanças estruturais causadas por perturbações genéticas ou ambientais. A imagem de todo o cérebro resulta em quantificação mais precisa das células e no estudo de diferenças específicas da região que podem ser perdidas com a microscopia comumente usada de tecido fisicamente seccionado. O uso de microscopia de folha de luz para visualizar cérebros limpos aumenta muito a velocidade de aquisição em comparação com a microscopia confocal. Embora essas imagens produzam quantidades muito grandes de dados estruturais cerebrais, a maioria das ferramentas computacionais que realizam a quantificação de características em imagens de tecido limpo são limitadas à contagem de populações de células esparsas, em vez de todos os núcleos.
Aqui, demonstramos o NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), um grupo de ferramentas de análise, para quantificar todos os núcleos e marcadores nucleares dentro de regiões anotadas de um cérebro de rato pós-natal dia 4 (P4) após limpeza e imagem em um microscópio de folha de luz. Descrevemos a ressonância magnética (RM) para medir o volume cerebral antes do encolhimento causado pelas etapas de desidratação da limpeza do tecido, limpeza do tecido usando o método iDISCO +, incluindo imunomarcação, seguida de microscopia de folha de luz usando uma plataforma comercialmente disponível para visualizar cérebros de camundongos em resolução celular. Em seguida, demonstramos esse pipeline de análise de imagem usando o NuMorph, que é usado para corrigir diferenças de intensidade, costurar blocos de imagem, alinhar vários canais, contar núcleos e anotar regiões cerebrais por meio do registro em atlas disponíveis publicamente.
Projetamos essa abordagem usando protocolos e softwares disponíveis publicamente, permitindo que qualquer pesquisador com o microscópio e os recursos computacionais necessários para realizar essas técnicas. Essas ferramentas de limpeza de tecidos, imagens e computação permitem a medição e quantificação da organização tridimensional (3D) dos tipos de células no córtex e devem ser amplamente aplicáveis a qualquer projeto de estudo de camundongo do tipo selvagem / knockout.
A imagem de todo o cérebro em resolução de célula única é um desafio importante na neurociência. As imagens cerebrais de resolução celular permitem a análise detalhada e o mapeamento em nível de sistema dos circuitos cerebrais e como esses circuitos são interrompidos por fatores de risco genéticos ou ambientais para distúrbios neuropsiquiátricos, comportamento celular em embriões em desenvolvimento, bem como circuitos neurais no cérebro adulto 1,2,3. Existem vários métodos histológicos que permitem imagens de alta resolução do cérebro 3D reconstruído; no entanto, essas técnicas requerem equipamentos caros e especializados, podem não ser compatíveis com a imunomarcação e a natureza bidimensional (2D) de alguns métodos pode levar a danos teciduais e cisalhamento durante a seccionamento 4,5.
Avanços recentes forneceram uma abordagem alternativa para a imagem de cérebros inteiros que não requer seccionamento de tecidos; eles envolvem o uso de limpeza de tecidos para tornar os cérebros transparentes. A transparência é alcançada na maioria dos métodos de limpeza tecidual tanto pela remoção de lipídios, pois eles são uma importante fonte de espalhamento de luz, quanto pela correspondência do índice de refração (IR) do objeto com o IR da solução de imersão da amostra durante a imagem. A luz pode então passar através da fronteira entre os materiais sem ser espalhada 6,7,8,9.
Métodos de clareamento tecidual, como o iDISCO+, são frequentemente combinados com imagens 3D rápidas usando microscopia de excitação de fóton único, como LSFM 6,7,10. Dentro de tecidos transparentes marcados com fluoróforo, as imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz são seções por excitação com um plano fino de luz11. A principal vantagem do LSFM é que uma única seção óptica é iluminada de cada vez, com toda a fluorescência das moléculas dentro dessa seção sendo excitada, o que minimiza o fotobranqueamento. Além disso, a imagem de uma fatia óptica inteira permite a detecção baseada em câmera dessa fatia excitada, aumentando a velocidade em relação à varredura pontual12. O LSFM produz de forma não destrutiva seções ópticas bem registradas que são adequadas para reconstrução 3D.
Embora o método iDISCO+ permita a limpeza de tecidos de baixo custo dentro de ~3 semanas, as etapas de desidratação dentro do protocolo podem levar ao encolhimento tecidual e potencial alteração da morfologia da amostra, afetando assim as medidas volumétricas 6,10. A adição de um método de imagem secundário, como a ressonância magnética, a ser usado antes do procedimento de limpeza de tecidos pode medir o grau de encolhimento induzido pela limpeza tecidual em toda a amostra. Durante as etapas de desidratação, diferenças nas propriedades mecânicas entre a substância cinzenta e a substância branca podem levar a deformações não uniformes da substância cerebral, resultando em deformações de volume induzidas por clareamento tecidual diferentes entre amostras do tipo selvagem e mutantes e podem confundir interpretações de diferenças volumétricas nessas amostras10,13 . A RNM é realizada primeiro perfundindo o animal com um agente de contraste (por exemplo, gadolínio), seguido pela incubação do tecido extraído de interesse em uma solução de imersão (por exemplo, fomblin) antes da imagem14. A RNM é compatível com a limpeza tecidual e a realização de LSFM na mesma amostra.
O LSFM é frequentemente usado para criar imagens de microscopia em larga escala para visualização qualitativa do tecido cerebral de interesse, em vez de avaliação quantitativa da estrutura cerebral (Figura 1). Sem avaliação quantitativa, é difícil demonstrar diferenças estruturais resultantes de insultos genéticos ou ambientais. À medida que as tecnologias de limpeza de tecidos e imagem melhoram, juntamente com a diminuição dos custos de armazenamento e poder de computação, a quantificação das localizações de tipo celular dentro do tecido de interesse está se tornando mais acessível, permitindo que mais pesquisadores incluam esses dados em seus estudos.
Com mais de 100 milhões de células no cérebro do rato15 e sessões de imagem de todo o cérebro que podem gerar terabytes de dados, há uma demanda crescente por ferramentas avançadas de análise de imagem que permitem a quantificação precisa de recursos dentro das imagens, como células. Existe uma série de métodos de segmentação para imagens limpas por tecidos que aplicam limiares para intensidade de coloração nuclear e filtram objetos com formas, tamanhos ou densidades predefinidos10,16,17,18. No entanto, interpretações imprecisas dos resultados podem surgir de variações em parâmetros como tamanho da célula, contraste da imagem e intensidade da rotulagem. Este artigo descreve nosso protocolo estabelecido para quantificar núcleos celulares no cérebro de camundongos. Primeiro, detalhamos as etapas para a coleta de tecidos do cérebro de camundongo P4, seguidas por um protocolo de limpeza tecidual e imunomarcação otimizado a partir do método iDISCO+disponível publicamente 10. Em segundo lugar, descrevemos a aquisição de imagens usando ressonância magnética e microscopia de folha de luz, incluindo os parâmetros utilizados para a captura de imagens. Finalmente, descrevemos e demonstramos o NuMorph19, um conjunto de ferramentas de análise de imagens que nosso grupo desenvolveu que permite quantificação específica do tipo celular após a limpeza tecidual, imunomarcação com marcadores nucleares e imagem de folha de luz de regiões anotadas.
Os métodos de limpeza de tecidos são técnicas úteis para medir a organização celular 3D do cérebro. Há uma série de métodos de clareamento tecidual descritos na literatura, cada um com suas vantagens e limitações 6,7,8,9. As opções de ferramentas computacionais para analisar os tipos de células nas imagens limpas por tecidos são relativamente limitadas. Outras ferramentas dispon…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R01MH121433, R01MH118349 e R01MH120125 para JLS e R01NS110791 para GW) e pela Fundação da Esperança. Agradecemos a Pablo Ariel, do Laboratório de Serviços de Microscopia, por auxiliar na imagem da amostra. O Laboratório de Serviços de Microscopia no Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial é apoiado em parte pelo Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 para o Centro Abrangente de Câncer Lineberger da Universidade da Carolina do Norte (UNC). O Núcleo de Microscopia de Neurociência é suportado pela concessão P30 NS045892. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada em parte pelo North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
EVO 860 4TB external SSD | |||
Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
ITK Snap | segmentation software | ||
Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
Antibody | Working concentration | ||
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |