Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

A imagem de todo o cérebro em resolução de célula única é um desafio importante na neurociência. As imagens cerebrais de resolução celular permitem a análise detalhada e o mapeamento em nível de sistema dos circuitos cerebrais e como esses circuitos são interrompidos por fatores de risco genéticos ou ambientais para distúrbios neuropsiquiátricos, comportamento celular em embriões em desenvolvimento, bem como circuitos neurais no cérebro adulto ^1,2,3. Existem vários métodos histológicos que permitem imagens de alta resolução do cérebro 3D reconstruído; no entanto, essas técnicas requerem equipamentos caros e especializados, podem não ser compatíveis com a imunomarcação e a natureza bidimensional (2D) de alguns métodos pode levar a danos teciduais e cisalhamento durante a seccionamento ^4,5.

Avanços recentes forneceram uma abordagem alternativa para a imagem de cérebros inteiros que não requer seccionamento de tecidos; eles envolvem o uso de limpeza de tecidos para tornar os cérebros transparentes. A transparência é alcançada na maioria dos métodos de limpeza tecidual tanto pela remoção de lipídios, pois eles são uma importante fonte de espalhamento de luz, quanto pela correspondência do índice de refração (IR) do objeto com o IR da solução de imersão da amostra durante a imagem. A luz pode então passar através da fronteira entre os materiais sem ser espalhada 6,7,8,9.

Métodos de clareamento tecidual, como o iDISCO+, são frequentemente combinados com imagens 3D rápidas usando microscopia de excitação de fóton único, como LSFM 6,7,10. Dentro de tecidos transparentes marcados com fluoróforo, as imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz são seções por excitação com um plano fino de luz¹¹. A principal vantagem do LSFM é que uma única seção óptica é iluminada de cada vez, com toda a fluorescência das moléculas dentro dessa seção sendo excitada, o que minimiza o fotobranqueamento. Além disso, a imagem de uma fatia óptica inteira permite a detecção baseada em câmera dessa fatia excitada, aumentando a velocidade em relação à varredura pontual¹². O LSFM produz de forma não destrutiva seções ópticas bem registradas que são adequadas para reconstrução 3D.

Embora o método iDISCO+ permita a limpeza de tecidos de baixo custo dentro de ~3 semanas, as etapas de desidratação dentro do protocolo podem levar ao encolhimento tecidual e potencial alteração da morfologia da amostra, afetando assim as medidas volumétricas ^6,10. A adição de um método de imagem secundário, como a ressonância magnética, a ser usado antes do procedimento de limpeza de tecidos pode medir o grau de encolhimento induzido pela limpeza tecidual em toda a amostra. Durante as etapas de desidratação, diferenças nas propriedades mecânicas entre a substância cinzenta e a substância branca podem levar a deformações não uniformes da substância cerebral, resultando em deformações de volume induzidas por clareamento tecidual diferentes entre amostras do tipo selvagem e mutantes e podem confundir interpretações de diferenças volumétricas nessas amostras^10,13 . A RNM é realizada primeiro perfundindo o animal com um agente de contraste (por exemplo, gadolínio), seguido pela incubação do tecido extraído de interesse em uma solução de imersão (por exemplo, fomblin) antes da imagem¹⁴. A RNM é compatível com a limpeza tecidual e a realização de LSFM na mesma amostra.

O LSFM é frequentemente usado para criar imagens de microscopia em larga escala para visualização qualitativa do tecido cerebral de interesse, em vez de avaliação quantitativa da estrutura cerebral (Figura 1). Sem avaliação quantitativa, é difícil demonstrar diferenças estruturais resultantes de insultos genéticos ou ambientais. À medida que as tecnologias de limpeza de tecidos e imagem melhoram, juntamente com a diminuição dos custos de armazenamento e poder de computação, a quantificação das localizações de tipo celular dentro do tecido de interesse está se tornando mais acessível, permitindo que mais pesquisadores incluam esses dados em seus estudos.

Com mais de 100 milhões de células no cérebro do rato¹⁵ e sessões de imagem de todo o cérebro que podem gerar terabytes de dados, há uma demanda crescente por ferramentas avançadas de análise de imagem que permitem a quantificação precisa de recursos dentro das imagens, como células. Existe uma série de métodos de segmentação para imagens limpas por tecidos que aplicam limiares para intensidade de coloração nuclear e filtram objetos com formas, tamanhos ou densidades predefinidos^10,16,17,18. No entanto, interpretações imprecisas dos resultados podem surgir de variações em parâmetros como tamanho da célula, contraste da imagem e intensidade da rotulagem. Este artigo descreve nosso protocolo estabelecido para quantificar núcleos celulares no cérebro de camundongos. Primeiro, detalhamos as etapas para a coleta de tecidos do cérebro de camundongo P4, seguidas por um protocolo de limpeza tecidual e imunomarcação otimizado a partir do método iDISCO+^{disponível publicamente 10}. Em segundo lugar, descrevemos a aquisição de imagens usando ressonância magnética e microscopia de folha de luz, incluindo os parâmetros utilizados para a captura de imagens. Finalmente, descrevemos e demonstramos o NuMorph¹⁹, um conjunto de ferramentas de análise de imagens que nosso grupo desenvolveu que permite quantificação específica do tipo celular após a limpeza tecidual, imunomarcação com marcadores nucleares e imagem de folha de luz de regiões anotadas.