מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית
Summary
בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.
Abstract
ניתן להשתמש במספר שיטות כדי לדמיין תאים בודדים בכל הגוף של דגי זברה עובריים, זחליים או צעירים. אנו מראים כי דגים חיים עם קרומי פלזמה המסומנים בפלואורסצנטיות יכולים להיסרק במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי על מנת לקבוע את נפח רקמת השריר ואת מספר סיבי השריר הקיימים. גישות יעילות למדידת מספר וגודל התאים בבעלי חיים חיים לאורך זמן מתוארות ומאומתות מול שיטות סגמנטציה מפרכות יותר. מתוארות שיטות המאפשרות שליטה על פעילות חשמלית השרירים, ובכך התכווצות. אובדן פעילות התכווצות שרירי השלד הפחית מאוד את צמיחת השרירים. בזחלים, מתואר פרוטוקול המאפשר הכנסה מחדש של פעילות התכווצות חשמלית מעוררת. השיטות המתוארות ממזערות את השפעת השונות הבין-אישית ויאפשרו ניתוח של השפעת גירויים חשמליים, גנטיים, תרופתיים או סביבתיים על מגוון פרמטרים של גדילה תאית ופיזיולוגית בהקשר של האורגניזם החי. לאחר מכן ניתן לבצע מעקב ארוך טווח אחר ההשפעות הנמדדות של התערבות מוגדרת בתחילת החיים על אנשים.
Introduction
צמיחת רקמות מוסדרת, הכוללת גידול במספר התאים (היפרפלזיה) ו/או בגודל התא (היפרטרופיה), היא גורם מכריע בהתפתחות, התחדשות והסתגלות אקולוגית ואבולוציונית. למרות ההתקדמות העצומה בהבנה הגנטית המולקולרית של ביולוגיה תאית והתפתחותית בעשורים האחרונים, ההבנה המכניסטית של ויסות גודל הרקמות והאיברים עדיין בחיתוליה. אחת הסיבות ללקונה זו בידע היא הקושי לכמת צמיחת רקמות באורגניזמים חיים בדיוק המרחבי והזמני הדרוש.
היבטים שונים של גדילה של אורגניזמים שלמים ניתנים למדידה חוזרת ונשנית לאורך זמן, וחושפים עקומות גדילה עבור כלאדם 1,2,3,4,5. שיטות סריקה מתוחכמות יותר ויותר, כגון אבסורפטיומטריה של קרני רנטגן כפולות (DXA), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI), מאפשרות מעקב אחר צמיחה של איברים שלמים ואזורי גוף אחרים (לדוגמה, שרירי שלד שזוהו על ידי יחידים) אצל אנשים בודדים, הן בבני אדם והן באורגניזמים מודל 6,7,8,9,10 . עם זאת, לשיטות אלה עדיין אין את הרזולוציה לחשוף תאים בודדים ולכן קשה היה להבחין בקשרים בין התנהגויות תאיות לצמיחה ברמת הרקמה. כדי ליצור קשרים כאלה, מחקרים מסורתיים הסתמכו לעתים קרובות על קבוצות של בעלי חיים בודדים דומים, שכמה מהם מוקרבים בנקודות זמן עוקבות ולאחר מכן מנותחים בפירוט ציטולוגי. גישות כאלה דורשות ממוצע של השינויים הנצפים בין קבוצות של פרטים (רצוי דומים, אך בכל זאת משתנים) ולכן סובלות מהיעדר רזולוציה טמפורלית ומרחבית, מה שמקשה על מציאת אירועים מתואמים ברמה התאית המרמזים על סיבה ותוצאה.
מחקרים על אורגניזמים מודל חסרי חוליות, בתחילה ב- C. elegans ו- D. melanogaster, עקפו את הבעיות הללו על ידי פיתוח מיקרוסקופיה אופטית כדי להשיג רזולוציה תאית ולמדוד במדויק צמיחה לאורך זמן אצל פרטים בודדים. מחקרים כאלה חשפו התנהגויות של שושלת תאים אינווריאנטית להפליא בגדילתם של אורגניזמי מודל קטנים אלה 11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, לבעלי חיים רבים, כולל כל בעלי החוליות, יש שושלות תאים לא מוגדרות, והם שולטים בצמיחת רקמות על ידי תהליכי משוב מסתוריים המשמשים להפיכת תוכנית הגדילה המקודדת גנטית לאורגניזם תלת-ממדי פונקציונלי שכל הרקמות והאיברים המרכיבים אותו תואמים את גודלו. כדי להבין את תהליכי הצמיחה המורכבים האלה, רצוי לדמיין רקמות שלמות או איברים לאורך זמן אצל אנשים בודדים שניתן לתמרן אותם בניסוי על ידי התערבויות גנטיות, פרמקולוגיות או אחרות בזמן בחירה וההשפעה נותחה לאחר מכן.
לכל שרירי שלד בעלי חוליות יש גודל, צורה ותפקוד מוגדרים, ואינטראקציות מאופיינות היטב עם רקמות סמוכות, כגון עצם, גיד ועצבים. חלק מהשרירים קטנים, שוכבים ממש מתחת לעור ולכן הם מועמדים טובים למחקרי הדמיה ברזולוציה גבוהה. בדומה לרוב האיברים, כל שריר גדל במהלך החיים העובריים, לאחר הלידה והנעורים, לפני שהוא מגיע לגודל בוגר יציב. לשריר, לעומת זאת, יש גם יכולת ייחודית לשנות גודל במהלך החיים הבוגרים, תלוי בשימוש ובתזונה18, ולתכונה זו יש השפעה רבה על הכושר האורגניזמי, הביצועים הספורטיביים והחיים העצמאיים. אובדן מסת שריר ותפקוד בגיל מבוגר, סרקופניה, הוא נושא של דאגה גוברת עבור חברות המתמודדות עם אוכלוסייה מזדקנת 19,20,21.
אנחנו ואחרים התמקדנו בצמיחה של בלוקים מוגדרים של רקמת שריר השלד בגוף החוזר על עצמו באופן סגמנטלי של זחלי דגי זברה, כמערכת סגורה לכאורה המכילה כמה מאות תאים שבהם ניתן לצפות בצמיחה, תחזוקה ותיקון של רקמות ולתפעל אותן 22,23,24,25,26. בעוד שעבודה כמותית מסוימת דווחה בעבר 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, אין שיטה מפורטת ומאומתת למדידת צמיחת שרירים בפרטים תאיים באורגניזמים בעלי חוליות בודדים לאורך זמן. כאן מתואר פרוטוקול יעיל כיצד לבצע מדידות חוזרות כאלה, יחד עם אימות, ודוגמה לשימוש בו לניתוח שינויים בצמיחה היפרטרופית והיפרפלסטית בתגובה לפעילות חשמלית שהשתנתה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מדווחים על שיטה להערכה מדויקת ויעילה של נפח השריר של זחלי דגי זברה חיים בשלבים או בגרסאות גנטיות שבהן פיגמנטציה אינה מהווה מכשול גדול להדמיה וכאשר הרדמה חולפת ו/או אימוביליזציה נסבלת היטב. בעוד שהשתמשנו במיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, הגישות המתוארות ישימות למיקרוסקופיה קו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים חבים חוב עמוק למאמציהם של חברי המעבדה של יוז, ד”ר סיטראמיה אטילי, יאנה קות’, פרננדה בג’נקה, ויקטוריה ויליאמס, יניב היניטס, ג’ורג’יה ברגמין וולדימיר סנטקוב לפיתוח הפרוטוקולים המתוארים, ולהנרי רוהל, כריסטינה האמונד, דייוויד לנגנאו ופיטר קארי על שיתוף פלסמידים או קווי דגי זברה. SMH הוא מדען של המועצה למחקר רפואי (MRC) עם מענק תוכנית G1001029, MR/N021231/1 ו-MR/W001381/1. תואר שני החזיק בתוכנית הכשרה לדוקטורט MRC מקינגס קולג ‘בלונדון. עבודה זו נהנתה מהקלט הטריגונומטרי של דייוויד מ. רובינסון, חוקר, מנטור וחבר.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
Referências
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Biologia do Desenvolvimento. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Biologia do Desenvolvimento. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
