Visuell, enkeltmolekylær biokjemi studert gjennom mikrofluidiske kamre blir i stor grad tilrettelagt ved bruk av glassfat, gasstette sprøyter, stabile tilkoblinger av rør til strømningsceller og eliminering av bobler ved å plassere koblingsventiler mellom sprøyter og rør. Protokollen beskriver doble optiske feller som muliggjør visualisering av DNA-transaksjoner og intermolekylære interaksjoner.
Visuell biokjemi er en kraftig teknikk for å observere de stokastiske egenskapene til enkeltenzymer eller enzymkomplekser som er skjult i gjennomsnittet som foregår i bulkfasestudier. For å oppnå visualisering er dobbel optisk pinsett, hvor en felle er festet og den andre er mobil, fokusert i en kanal av et multi-stream mikrofluidisk kammer plassert på scenen av et omvendt fluorescensmikroskop. Den optiske pinsetten fanger enkeltmolekyler av fluorescerende merket DNA og væskestrøm gjennom kammeret og forbi de fangede perlene, strekker DNA til B-form (under minimal kraft, dvs. 0 pN) med nukleinsyren observert som en hvit streng mot en svart bakgrunn. DNA-molekyler flyttes fra en strøm til den neste, ved å oversette scenen vinkelrett på strømmen for å muliggjøre initiering av reaksjoner på en kontrollert måte. For å oppnå suksess parres mikrofluidiske enheter med optisk klare kanaler til glasssprøyter som holdes på plass i en sprøytepumpe. Optimale resultater bruker kontakter permanent bundet til strømningscellen, rør som er mekanisk stive og kjemisk motstandsdyktige, og som er koblet til koblingsventiler som eliminerer bobler som forbyr laminær strømning.
Evnen til å visualisere protein-DNA-interaksjoner på enkeltmolekylnivå og i sanntid har gitt betydelig innsikt i genomstabilitet 1,2. I tillegg til å jobbe med enkeltmolekyler av DNA en om gangen, gir evnen til å se transaksjoner mellom individuelle molekyler i nærheten ytterligere innsikt 3,4,5. Manipulering av ytterligere DNA-molekyler krever både ekstra optiske feller samt høykvalitets, flerkanals, mikrofluidiske strømningsceller6.
Det finnes flere metoder tilgjengelig for å generere mer enn én optisk felle. Disse inkluderer galvanometerskanningsspeil, akustiske optiske modulatorer og diffraktiv optikk, som genererer holografisk optisk pinsett 4,7,8,9. Ofte produserer skannespeil og akustiske optiske modulatorer feller som timeshare. I oppsettet som er beskrevet her, er strålen til en enkelt Nd: YAG-laser delt på polarisasjon, og deretter kontrollerer galvanometer laserskanningsspeil posisjonen til det som kalles mobilfellen (figur 1) 4. For å lette plasseringen av speil og filtre for å lede fangststrålen til bakåpningen på mikroskopmålet, brukes en HeNe-laser. Dette gjør den generelle justeringen enklere ettersom HeNe-strålen er synlig for det blotte øye, mens infrarøde stråler ikke er det. HeNe-strålen er også tryggere å jobbe med, noe som gjør plasseringen av speil og andre komponenter mindre stressende. I utgangspunktet er strålebanen for denne laseren skilt fra 1064 nm-strålen, men blir introdusert i samme strålebane, og deretter inn i mikroskopmålet. Når fysisk justering er oppnådd, er posisjonering av 1064 nm strålen på toppen av HeNe-strålen gjort, og dette forenkles ved bruk av en infrarød seer og ulike strålebildeverktøy for å visualisere stråleposisjon og kvalitet. Deretter introduseres stråleutvidelsen, og den resulterende utvidede infrarøde strålen er justert på baksiden av målet. Til slutt fjernes målet og kraften i hver polarisert stråle måles og justeres ved hjelp av λ/2 bølgeplater for å være lik (figur 1C). Effektmålinger gjøres også når målet er returnert, og vanligvis er det et strømtap på 53%. Det er imidlertid tilstrekkelig kraft til å danne stabile faste og bevegelige optiske feller i fokalplanet (figur 1D).
For å avbilde DNA-transaksjoner spiller mikrofluidiske strømningsceller en nøkkelrolle da de tillater kontrollerte målinger på enkeltmolekylnivå med høy romlig og tidsmessig oppløsning (figur 2). Begrepet mikrofluidisk refererer til evnen til å manipulere væsker i en eller flere kanaler med dimensjoner fra 5-500 μm10,11. Begrepet strøm refererer til den faktiske væsken i en kanal, og kanalen refererer til den fysiske kanalen der en væskestrøm eller strømmer beveger seg. Enkanals strømningscelledesign har en felles, fysisk kanal hvor reaksjoner observeres, og det er vanligvis bare en væskestrøm tilstede. Dermed er disse designene kjent som single-stream flow celler. I motsetning til dette er flerstrømsstrømningsceller definert som en mikrofluidisk enhet der to eller flere inngangskanaler konvergerer til en enkelt, vanlig, fysisk kanal (figur 2A). Innenfor den felles kanalen strømmer væskestrømmene som stammer fra de enkelte kanalene parallelt med hverandre, og forblir separert med bare minimal blanding mellom dem som oppstår på grunn av diffusjon (figur 2B). I de fleste eksperimentelle oppsett skyver en enkelt pumpe væsker inn i hver kanal med samme hastighet. I kontrast, når grensestyring brukes, skyver tre eller flere, uavhengig kontrollerte pumper væsker gjennom kanalene. Imidlertid opererer hver pumpe med forskjellig hastighet, men nettostrømningshastigheten i den vanlige kanalen er konstant12. Dette tillater rask utveksling av hovedkanalkomponenter ganske enkelt ved å endre pumpehastigheten.
I tillegg til laminær strømning er en annen kritisk faktor den parabolske hastighetsprofilen i den laminære væskestrømmen. Den høyeste strømningshastigheten skjer midt i strømmen, og den tregeste oppstår ved siden av overflatene (figur 2C)13. Denne profilen må vurderes for å strekke et DNA-molekyl som er festet til en perle som holdes i strømmen for presis visualisering av fluorescerende DNA og nøyaktige enkeltmolekylanalyser. Her strekkes DNA-et til B-form og holdes på plass under 0 pN kraft. For å oppnå dette, bør fokusering av den optiske felleposisjonen være til en posisjon 10-20 μm fra bunndekselets overflate (figur 2D). Det må utvises forsiktighet slik at DNA-molekylet ikke strekkes utover B-form, da dette kan hemme enzymreaksjoner. Under typiske bufferforhold er 1 μm = 3000 bp DNA14. Videre, ved å fange 10-20 μm fra dekselet, er DNA-komplekset plassert langt fra overflaten og minimerer dermed overflateinteraksjoner.
Mange metoder har blitt brukt til å lage mikrofluidiske enhetskanaler, og disse kan gjøres i laboratoriet eller strømningsceller kan kjøpes fra kommersielle kilder 6,15,16,17. De optimale materialene som brukes til å konstruere strømningscellene, må være mekanisk stive, optisk gjennomsiktige med lav fluorescens og ugjennomtrengelige for organiske løsningsmidler6. Ofte brukes borosilikatfløteglass eller smeltet silika for å gi et stabilt strømningsmiljø i lengre tid som er egnet for optisk fangst, visualisering og kraftdeteksjon. Disse materialene tillater også bruk av ikke-vandige løsningsmidler (f.eks. metanol av spektrofotometrisk kvalitet) for å forenkle overflatefukting og fjerning av luftbobler, og denaturanter (f.eks. 6M guanidiniumhydroklorid) eller vaskemidler for å rengjøre strømningscellen. Til slutt varierer metodene som brukes til å introdusere væsker i strømningsceller fra komplekse vakuumpumpesystemer til enkeltsprøytepumper 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I tilnærmingen som er beskrevet her, brukes en sprøytepumpe med plass til opptil 10 sprøyter (figur 3A). Dette gir fleksibilitet til å bruke enkeltkanals flytceller eller flytceller med flere innløpskanaler. Her brukes en trekanals strømningscelle og pares med sprøyter som holdes på plass på sprøytepumpen ved hjelp av poly-eter-eter-keton (PEEK) -rør (figur 3A-C). Strømmen av væsker styres av fireveis koblingsventiler og tjener dermed til å minimere innføringen av bobler i strømningscellen (figur 3A, D). I tillegg anbefales Hamilton gasstette sprøyter som har stive glassvegger og polytetrafluoretylen (PTFE)-belagte stempler, da de gir eksepsjonelt jevn stempelbevegelse som er avgjørende for å oppnå en jevn flyt14,27.
I det eksperimentelle systemet som er beskrevet, har strømningsceller med to til fem innløpskanaler blitt brukt. Antall innløpskanaler dikteres av eksperimentet som gjøres. For studiet av RecBCD og Hop2-Mnd1 var to strømkanaler tilstrekkelig14,28. For helikasen ble enzymet bundet til den frie enden av DNA og oversatt til en strøm som inneholdt magnesium og ATP for å initiere translokasjon og avvikling. For Hop2-Mnd1 ble optisk fanget DNA oversatt til den tilstøtende væskestrømmen som inneholder proteiner og buffer ± divalente metallioner. Bruken av trekanals strømningsceller gjør det mulig å fange DNA i strøm 1, oversette DNA til strøm 2 for å tillate proteinbinding å forekomme, og deretter å streame 3 der ATP er tilstede, for eksempel for å initiere reaksjoner. En variant av ovenstående er å bruke fluorescerende merket protein i kanal 2, noe som resulterer i at væskestrømmen er helt hvit og utelukker visualisering av DNA. Når dette molekylet oversettes til strøm 3, er både proteiner og DNA nå synlige når reaksjoner initieres.
Bruken av fireveis koblingsventiler for å kontrollere væskestrømmen er en kritisk komponent i systemet for å eliminere bobler i strømningscellene. Bobler er skadelige for stabil væskestrøm når de trekker seg sammen og ekspanderer på uforutsigbare måter, noe som resulterer i raske endringer i strømningshastighet og innføring av turbulens. Når ventilene er plassert mellom sprøyter og innløpsrør, kobles strømningsbanen fra ved å bytte ventilposisjon når sprøyter skiftes ut. Når den nye sprøyten er satt på plass, kan stempelet trykkes ned manuelt slik at >6 μL kastes ut (ventilens dødvolum), og dette eliminerer bobler nesten helt.
Festing av kontakter til flytceller er ofte det hastighetsbegrensende trinnet i bruk av flytceller. Vi beskriver bruken av to typer kontakter: flyttbar kjent som press-fit og permanente (nanoport-enheter). De avtakbare kontaktene er enkle å feste til en flytcelle, og forskjellige typer fleksible rør i tillegg til den anbefalte PTFE kan testes med disse kontaktene. Dette er en rask og kostnadseffektiv måte å teste slanger og kontakter uten å ofre dyrere glassflytceller. I motsetning til dette er nanoportenheter festet permanent, tåler trykk opp til 1,000 psi, og i våre hender er bruken av dem begrenset til PEEK-rør med forskjellige diametre. Dette er ikke en ulempe da PEEK-slanger fortrinnsvis brukes. En enkelt glassflytcelle med permanente enheter festet kan gjenbrukes i mer enn 1 år med forsiktig bruk.
Den forsiktige monteringen av strømningssystemet er avgjørende for det vellykkede resultatet av eksperimenter 4,6. En av de mest utfordrende aspektene ved protokollen er festing av kontakter til glassoverflaten. For dette bruker vi følgende to tilnærminger: press-fit fit slangekontakter og nanoport-enheter. Press-fit-kontakter fester seg lett til glass etterfulgt av å skyve PTFE-rør inn i de forhåndsformede hullene ved hjelp av tang. Når et mer stabilt ve…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i Bianco-laboratoriet støttes av NIH-tilskudd GM100156 og GM144414 til PRB.
100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
Stage | Leica | ||
Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |