Bruk av dobbel optisk pinsett og mikrofluidikk for enkeltmolekylstudier

Evnen til å visualisere protein-DNA-interaksjoner på enkeltmolekylnivå og i sanntid har gitt betydelig innsikt i genomstabilitet ^1,2. I tillegg til å jobbe med enkeltmolekyler av DNA en om gangen, gir evnen til å se transaksjoner mellom individuelle molekyler i nærheten ytterligere innsikt ^3,4,5. Manipulering av ytterligere DNA-molekyler krever både ekstra optiske feller samt høykvalitets, flerkanals, mikrofluidiske strømningsceller⁶.

Det finnes flere metoder tilgjengelig for å generere mer enn én optisk felle. Disse inkluderer galvanometerskanningsspeil, akustiske optiske modulatorer og diffraktiv optikk, som genererer holografisk optisk pinsett 4,7,8,9. Ofte produserer skannespeil og akustiske optiske modulatorer feller som timeshare. I oppsettet som er beskrevet her, er strålen til en enkelt Nd: YAG-laser delt på polarisasjon, og deretter kontrollerer galvanometer laserskanningsspeil posisjonen til det som kalles mobilfellen (figur 1) ⁴. For å lette plasseringen av speil og filtre for å lede fangststrålen til bakåpningen på mikroskopmålet, brukes en HeNe-laser. Dette gjør den generelle justeringen enklere ettersom HeNe-strålen er synlig for det blotte øye, mens infrarøde stråler ikke er det. HeNe-strålen er også tryggere å jobbe med, noe som gjør plasseringen av speil og andre komponenter mindre stressende. I utgangspunktet er strålebanen for denne laseren skilt fra 1064 nm-strålen, men blir introdusert i samme strålebane, og deretter inn i mikroskopmålet. Når fysisk justering er oppnådd, er posisjonering av 1064 nm strålen på toppen av HeNe-strålen gjort, og dette forenkles ved bruk av en infrarød seer og ulike strålebildeverktøy for å visualisere stråleposisjon og kvalitet. Deretter introduseres stråleutvidelsen, og den resulterende utvidede infrarøde strålen er justert på baksiden av målet. Til slutt fjernes målet og kraften i hver polarisert stråle måles og justeres ved hjelp av λ/2 bølgeplater for å være lik (figur 1C). Effektmålinger gjøres også når målet er returnert, og vanligvis er det et strømtap på 53%. Det er imidlertid tilstrekkelig kraft til å danne stabile faste og bevegelige optiske feller i fokalplanet (figur 1D).

For å avbilde DNA-transaksjoner spiller mikrofluidiske strømningsceller en nøkkelrolle da de tillater kontrollerte målinger på enkeltmolekylnivå med høy romlig og tidsmessig oppløsning (figur 2). Begrepet mikrofluidisk refererer til evnen til å manipulere væsker i en eller flere kanaler med dimensjoner fra 5-500 μm^10,11. Begrepet strøm refererer til den faktiske væsken i en kanal, og kanalen refererer til den fysiske kanalen der en væskestrøm eller strømmer beveger seg. Enkanals strømningscelledesign har en felles, fysisk kanal hvor reaksjoner observeres, og det er vanligvis bare en væskestrøm tilstede. Dermed er disse designene kjent som single-stream flow celler. I motsetning til dette er flerstrømsstrømningsceller definert som en mikrofluidisk enhet der to eller flere inngangskanaler konvergerer til en enkelt, vanlig, fysisk kanal (figur 2A). Innenfor den felles kanalen strømmer væskestrømmene som stammer fra de enkelte kanalene parallelt med hverandre, og forblir separert med bare minimal blanding mellom dem som oppstår på grunn av diffusjon (figur 2B). I de fleste eksperimentelle oppsett skyver en enkelt pumpe væsker inn i hver kanal med samme hastighet. I kontrast, når grensestyring brukes, skyver tre eller flere, uavhengig kontrollerte pumper væsker gjennom kanalene. Imidlertid opererer hver pumpe med forskjellig hastighet, men nettostrømningshastigheten i den vanlige kanalen er konstant¹². Dette tillater rask utveksling av hovedkanalkomponenter ganske enkelt ved å endre pumpehastigheten.

I tillegg til laminær strømning er en annen kritisk faktor den parabolske hastighetsprofilen i den laminære væskestrømmen. Den høyeste strømningshastigheten skjer midt i strømmen, og den tregeste oppstår ved siden av overflatene (figur 2C)¹³. Denne profilen må vurderes for å strekke et DNA-molekyl som er festet til en perle som holdes i strømmen for presis visualisering av fluorescerende DNA og nøyaktige enkeltmolekylanalyser. Her strekkes DNA-et til B-form og holdes på plass under 0 pN kraft. For å oppnå dette, bør fokusering av den optiske felleposisjonen være til en posisjon 10-20 μm fra bunndekselets overflate (figur 2D). Det må utvises forsiktighet slik at DNA-molekylet ikke strekkes utover B-form, da dette kan hemme enzymreaksjoner. Under typiske bufferforhold er 1 μm = 3000 bp DNA¹⁴. Videre, ved å fange 10-20 μm fra dekselet, er DNA-komplekset plassert langt fra overflaten og minimerer dermed overflateinteraksjoner.

Mange metoder har blitt brukt til å lage mikrofluidiske enhetskanaler, og disse kan gjøres i laboratoriet eller strømningsceller kan kjøpes fra kommersielle kilder 6,15,16,17. De optimale materialene som brukes til å konstruere strømningscellene, må være mekanisk stive, optisk gjennomsiktige med lav fluorescens og ugjennomtrengelige for organiske løsningsmidler⁶. Ofte brukes borosilikatfløteglass eller smeltet silika for å gi et stabilt strømningsmiljø i lengre tid som er egnet for optisk fangst, visualisering og kraftdeteksjon. Disse materialene tillater også bruk av ikke-vandige løsningsmidler (f.eks. metanol av spektrofotometrisk kvalitet) for å forenkle overflatefukting og fjerning av luftbobler, og denaturanter (f.eks. 6M guanidiniumhydroklorid) eller vaskemidler for å rengjøre strømningscellen. Til slutt varierer metodene som brukes til å introdusere væsker i strømningsceller fra komplekse vakuumpumpesystemer til enkeltsprøytepumper 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I tilnærmingen som er beskrevet her, brukes en sprøytepumpe med plass til opptil 10 sprøyter (figur 3A). Dette gir fleksibilitet til å bruke enkeltkanals flytceller eller flytceller med flere innløpskanaler. Her brukes en trekanals strømningscelle og pares med sprøyter som holdes på plass på sprøytepumpen ved hjelp av poly-eter-eter-keton (PEEK) -rør (figur 3A-C). Strømmen av væsker styres av fireveis koblingsventiler og tjener dermed til å minimere innføringen av bobler i strømningscellen (figur 3A, D). I tillegg anbefales Hamilton gasstette sprøyter som har stive glassvegger og polytetrafluoretylen (PTFE)-belagte stempler, da de gir eksepsjonelt jevn stempelbevegelse som er avgjørende for å oppnå en jevn flyt^14,27.

I det eksperimentelle systemet som er beskrevet, har strømningsceller med to til fem innløpskanaler blitt brukt. Antall innløpskanaler dikteres av eksperimentet som gjøres. For studiet av RecBCD og Hop2-Mnd1 var to strømkanaler tilstrekkelig^14,28. For helikasen ble enzymet bundet til den frie enden av DNA og oversatt til en strøm som inneholdt magnesium og ATP for å initiere translokasjon og avvikling. For Hop2-Mnd1 ble optisk fanget DNA oversatt til den tilstøtende væskestrømmen som inneholder proteiner og buffer ± divalente metallioner. Bruken av trekanals strømningsceller gjør det mulig å fange DNA i strøm 1, oversette DNA til strøm 2 for å tillate proteinbinding å forekomme, og deretter å streame 3 der ATP er tilstede, for eksempel for å initiere reaksjoner. En variant av ovenstående er å bruke fluorescerende merket protein i kanal 2, noe som resulterer i at væskestrømmen er helt hvit og utelukker visualisering av DNA. Når dette molekylet oversettes til strøm 3, er både proteiner og DNA nå synlige når reaksjoner initieres.

Bruken av fireveis koblingsventiler for å kontrollere væskestrømmen er en kritisk komponent i systemet for å eliminere bobler i strømningscellene. Bobler er skadelige for stabil væskestrøm når de trekker seg sammen og ekspanderer på uforutsigbare måter, noe som resulterer i raske endringer i strømningshastighet og innføring av turbulens. Når ventilene er plassert mellom sprøyter og innløpsrør, kobles strømningsbanen fra ved å bytte ventilposisjon når sprøyter skiftes ut. Når den nye sprøyten er satt på plass, kan stempelet trykkes ned manuelt slik at >6 μL kastes ut (ventilens dødvolum), og dette eliminerer bobler nesten helt.

Festing av kontakter til flytceller er ofte det hastighetsbegrensende trinnet i bruk av flytceller. Vi beskriver bruken av to typer kontakter: flyttbar kjent som press-fit og permanente (nanoport-enheter). De avtakbare kontaktene er enkle å feste til en flytcelle, og forskjellige typer fleksible rør i tillegg til den anbefalte PTFE kan testes med disse kontaktene. Dette er en rask og kostnadseffektiv måte å teste slanger og kontakter uten å ofre dyrere glassflytceller. I motsetning til dette er nanoportenheter festet permanent, tåler trykk opp til 1,000 psi, og i våre hender er bruken av dem begrenset til PEEK-rør med forskjellige diametre. Dette er ikke en ulempe da PEEK-slanger fortrinnsvis brukes. En enkelt glassflytcelle med permanente enheter festet kan gjenbrukes i mer enn 1 år med forsiktig bruk.