Den nyeste generasjonen av EV-karakteriseringsverktøy er i stand til enkelt EV-analyse på tvers av flere parametere samtidig. Nano-flow cytometri måler alle biologiske partikler større enn 45 nm uten merking og identifiserer spesifikke egenskaper av underpopulasjoner ved en rekke fluorescerende merkingsteknikker.
Karakterisering av enkeltpartikler har blitt stadig mer relevant for forskning på ekstracellulære vesikler, som går fra bulkanalyseteknikker og førstegenerasjons partikkelanalyse til omfattende multiparametermålinger som nano-flow cytometri (nFCM). nFCM er en form for flowcytometri som benytter instrumentering spesielt utviklet for nanopartikkelanalyse, slik at tusenvis av elbiler kan karakteriseres per minutt både med og uten bruk av fargeteknikker. Deteksjon av høyoppløselig sidespredning (SS) gjør det mulig å bestemme størrelse og konsentrasjon for alle biologiske partikler større enn 45 nm, mens deteksjon av samtidig fluorescens (FL) identifiserer tilstedeværelsen av merkede markører og mål av interesse. Merkede underpopulasjoner kan deretter beskrives i kvantitative enheter av partikler/ml eller som en prosentandel av de totale partiklene identifisert ved sidespredning.
Her er elbiler avledet fra betingede cellekulturmedier (CCM) merket med både et lipidfargestoff, for å identifisere partikler med en membran, og antistoffer som er spesifikke for CD9, CD63 og CD81 som vanlige EV-markører. Målinger av sammenligningsmateriale, en konsentrasjonsstandard og en størrelsesstandard for silika nanosfærer, samt merket prøvemateriale analyseres i en 1-minutters analyse. Programvaren brukes deretter til å måle konsentrasjons- og størrelsesfordelingsprofilen til alle partikler, uavhengig av merking, før du bestemmer partiklene som er positive for hver av etikettene.
Samtidig SS- og FL-deteksjon kan brukes fleksibelt med mange forskjellige EV-kilder og merkingsmål, både eksterne og interne, som beskriver EV-prøver på en omfattende og kvantitativ måte.
Hva er elbiler?
Ekstracellulære vesikler (EV) er samlebetegnelsen for en rekke celleavledede membranøse partikler som er integrert i mange normale cellulære og vevsaktiviteter. Deres innvirkning på et bredt spekter av vitenskapelige felt og deres potensielle kliniske relevans har drevet en vekst i EV-forskning og industriell interesse1. Liten EV (sEV) forskning fokuserer primært på eksosomer, 40-100 nm partikler som begynner dannelse i de tidlige endosomene før modning og frigjøring gjennom fusjon av multi-vesikulære legemer (MVB) til plasmamembranen, samt mikrovesikler, som knopper direkte fra plasmamembranen som danner 80-1000 nm partikler2. En tredje EV-populasjon er apoptotiske legemer, 50-1,500 nm partikler dannet under celledød, noe som betyr at deres relative andel til andre elbiler kan være sterkt variabel3.
Fordi EV-egenskaper kan representere endringer som forekommer i deres celle / vev av opprinnelse, er det potensial for bruk i diagnostikk. Ulike “omics” -analyser har begynt å identifisere markører for celleopprinnelse og sykdomstilstand, noe som kan muliggjøre ikke-invasiv vurdering av pasienter ved hjelp av EV-kilder som blodplasma / serum, urin, spytt og cerebral spinalvæske (CSF) 4,5. En drivkraft bak disse EV-relaterte innovasjonene er nye karakteriseringsteknikker som overvinner tidligere begrensninger.
Behovet for, og utfordringene med, karakterisering av én elbil
Single EV-karakterisering blir stadig viktigere for både validering og beskrivelse av EV-isolater, samt belyser nøkkelegenskaper ved disse nanopartiklene for progresjon av EV-baserte terapier og diagnostikk6. Avhengig av EV-kilden og tiltenkt bruk, kan analyse av renhet, ofte beskrevet som et forhold mellom EV og ikke-EV-partikler eller som EV til fritt protein, kreve betydelige mengder data fra flere analyser7.
Partikkeltelling og dimensjoneringsmålinger i EV-publikasjoner har tidligere stolt sterkt på Nanopartikkelsporing (NTA), resistiv pulsmåling (RPS) og elektronmikroskopi (EM) 2. Standard NTA og RPS mangler evnen til å skille elbiler fra ikke-EV-partikler og har sine egne advarsler som langsom gjennomstrømning8 og uegnet nedre deteksjonsgrense sett med NTA 9,10,11.
Tetraspaninene CD9, CD63 og CD81 har historisk sett vært viktige identifikatorer for tilstedeværelsen av elbiler i EV-isolasjoner/preparater. Vanligvis brukes western blotting (WB) og dot blotting teknikker for å vise anrikning av disse proteinene i EV-isolater sammenlignet med cellelysat12. Imidlertid oppfordrer mangelen på kvantifisering til disse metodene og heterogeniteten til disse EV-markørene, både når det gjelder visning i EV-underpopulasjoner og celle-, vevs- eller pasientrelatert variasjon, avanserte analytiske teknikker, som forener fysisk og fenotypisk karakterisering13.
Nano-flow cytometri som en omfattende EV analyse teknikk
Bestemmelse av sanne EV-konsentrasjoner krever identifisering av intakte partikler og en universell markør, spesielt i komplekse partikkelisolater, med oppløsning som er i stand til å oppdage alle elbiler mens de skiller dem fra ikke-EV-partikler14.
Nano-flow cytometri (nFCM) er en teknikk som tillater umerket analyse av partikler størrelse mellom 45-1000 nm samtidig som fluorescerende merking og deteksjon for å identifisere partikkel subpopulasjoner. Et viktig skille fra konvensjonell flowcytometri er bruken av utstyr dedikert til nanopartikkelanalyse, noe som gir størst oppløsning15. EV-analyse, som bruker konvensjonell strømningsinstrumentering repurposed for liten partikkelanalyse, forbedres, men sliter fortsatt med å oppnå oppløsningen for å oppdage og analysere < 100 nm EV16,17. Perlebasert flowcytometri er en ytterligere tilpasning som ofte brukes til EV-analyse, men dette fjerner muligheten for enkeltpartikkeldeteksjon og introduserer fangstbaserte skjevheter18.
Ved å dra nytte av en nedre deteksjonsgrense på ~ 45 nm i sidespredningskanalen (SS) for EV-analyse, bruker nFCM SS-utløsing. Dette kan betraktes som “partikkel først” -analyse, da det betyr at hendelser må gi et SS-signal, som overskrider en angitt terskel før analyse av fluorescensintensiteten. Dette fjerner falske positiver som nedbrutt membran og fluoroforaggregeringer, og fokuserer analysen på intakte elbiler15. SS-målinger brukes også til å dimensjonere individuelle partikler sammenlignet med en firemodal silika nanosfærestandard19. Fluorescensmålingene er tatt på ytterligere to detektorer som tillater tre samtidige målinger for hver partikkel for å beskrive partikkelkonsentrasjon, størrelser og tilstedeværelse av markører eller andre mål av interesse for å identifisere EV-underpopulasjoner20.
I det følgende eksperimentet brukes SS- og fluorescerende (FL) målinger til å måle >45 nm partikler, vise delmengden av membranpositive elbiler og identifisere CD9, CD63, CD81-presentasjon på EV-underpopulasjoner. Både konsentrasjonen av disse subpopulasjonene og deres forhold som en del av de totale partiklene målt ved SS er beskrevet, og det samme er deres størrelsesprofiler.
Eksempel- og reagensdetaljer
To EV-isolater fra separate cellelinjer ble valgt for demonstrasjon av fluorescerende merking og påfølgende nFCM-analyse. Begge EV-settene ble suspendert i PBS og lagret ved -80 ° C i <3 måneder, men de fleste andre forhold var forskjellige mellom isolater. C2C12-musemyoblastcellelinjen representerer en embryonal forløper til skjelettmuskelceller og ble dyrket i 2D-kultur, og kondisjonerte vekstmediet over 72 timer før EV-isolasjon ved ultracentrifugering. SW620 er en human kolon adenokarsinom cellelinje og ble dyrket i en rudimentær bioreaktor, berikende media over 7 uker, med EV-isolasjon utført ved størrelse eksklusjonskromatografi (SEC) og fraksjoner 7-9 eluert fra sepharose CL-2B kolonner kombinert i en enkelt prøve.
Mens elbiler isolert og konsentrert fra CCM er de enkleste prøvetypene å jobbe med, gjelder nFCM for de fleste EV-isolater, inkludert biofluider som serum, plasma, urin og CSF. Disse prøveanalysene drar nytte av nFCM SS-deteksjon av alle partikler, noe som muliggjør bekreftelse med NTA, TRPS og andre partikkelanalyser, samtidig som de beskriver de fluorescerende merkede EV-underpopulasjonene i kvantitative termer så vel som en andel av totalen, for en objektiv tilnærming til multiparameterpartikkelanalyse. Analyse av lavt bearbeidede prøver er også mulig, for eksempel uavklart urin og EV-beriket CCM med forbehold om å kreve lavt forurenset protein.
Membranfargestoffet som brukes her er ment å integreres i lipid-dobbeltlaget, med en lipofil del for membranbelastning og et hydrofilt fargestoff for å forbli i plasmamembranen25. Det er for tiden ingen perfekt EV-merkingsfargestoff, og flere kriterier må vurderes når du velger, inkludert spesifisitet til elbiler, egnethet med fiksering eller permeabilisering, og effektiviteten til EV-merking26.
Fluorescerende konjugert antistoffmerking av overflateeksponerte epitoper har vist seg å være en effektiv metode for å identifisere EV-underpopulasjoner27. Et viktig aspekt ved protokolloptimalisering er å møte, og ikke overskride, merkingsmetningspunktet for å binde seg til alle tilgjengelige epitoper uten å hemme deteksjon av partikler med lav fluorescens ved å la den omkringliggende bufferen fylles med fluorescerende ubundet antistoff28. I tillegg er tilgjengeligheten av eksponerte bindingssteder for antistoffmerking potensielt påvirket av flere faktorer. Lagringsforhold for elbiler har vist seg å påvirke konsentrasjons- og størrelsesprofiler for elbiler29 , med observasjoner som også indikerer effekter på antistoffmerking30. Tilstedeværelsen av overflatekoronaproteiner, proteinmodifikasjoner og virkninger av isolasjonsteknikker kan også ha effekter på antistoffmerking i noen tilfeller. Til slutt, ettersom bruken av fluorescerende merking blir mer utbredt for EV-studier, vil eksperimentell design og optimalisering for flere analytiske teknikker bli mer raffinert.
For å øke nøyaktigheten av resultatene, kan flere kontroller inkluderes som (1) PBS + fargestoffkontroll, for å vurdere micelle- eller aggregatdannelse i noen fargestoffer, som kan vises som SS + -partikler i nFCM-analyse, (2) PBS + antistoffkontroll, aggregater kan forekomme, men ofte ikke store nok til å spre nok lys til SS-deteksjon, (3) EV-prøve + IgG-antistoffkontroll, vanlig i flowcytometri og brukes til å identifisere ikke-spesifikk binding, (4) ikke-EV-partikkelprøve + antistoff / fargestoffkontroll – spesielt viktig når du trenger å identifisere elbiler i komplekse partikkelprøver, kontroller som renset LDL-partikler (Low-density lipoprotein) eller EV-utarmede / ablerte prøver kan fungere som en negativ kontroll for å validere selektiv merking, (5) positive kontroller er vanskelig å designe, men validering av et antistoff på celler er en nyttig inkludering.
Presentasjon av tetraspaniner på elbiler
Antistoff- og membranmerkingen av dette eksperimentet demonstrerer det høye nivået av kvantitative data som kan oppnås i en liten tidsramme ved nFCM-analyse. Samtidig måling av de viktigste fysiske egenskapene til partikkeldiameter/konsentrasjon med fenotypiske målinger av membran- og/eller proteintilstedeværelse fører til høye nivåbeskrivelser av underpopulasjoner innen partikkelisolering.
Det er viktig at varierende nivåer av de tre “viktige” EV-relaterte tetraspaninene, CD9, CD63, CD81, ble identifisert i disse to EV-prøvene. CD9 ble presentert på den største andelen elbiler for både C2C12-avledede elbiler og SW620, med CD81 og CD63 som henholdsvis det andre og minst presenterte proteinet.
Til tross for noen likheter observert her i tetraspaninprofilene til elbiler fra to svært forskjellige cellekilder, kan nivåene av CD9, CD63 og CD81 være svært forskjellige mellom cellelinje og pasientavledede EV31.
Forskjellen i CD63-uttrykk mellom de to EV-prøvene er spesielt relevant for den pågående diskusjonen om nøkkelidentifikatorer for ‘EV-ness’. Mens presentasjon av CD63 i bare ~ 8% av SW620 EV kan være uventet av noen, har CD63 blitt foreslått som dårlig identifikator for de forskjellige typer EV isolert etter størrelse eller tetthet32, og tetraspanin negative EV har blitt identifisert, selv når beskrevet som exosome-lignende33.
Identifisering av elbiler i komplekse partikkelisolasjoner
Heterogeniteten til EV-tetraspaninprofiler, både i cellelinje og pasientavledede elbiler, advarer mot avhengighet av tetraspaninbasert fangst av elbiler og fremhever det fremtidige behovet for nye EV-identifikasjonsmetoder31. EV-merking uavhengig av spesifikke proteiner kan vise seg å være svært gunstig for å identifisere EV-er fra lignende størrelse ikke-EV-partikler hvis EV-spesifisitet kan bevises å være svært høy. Dette gjelder spesielt for biofluid EV-isolater, da det har blitt foreslått at konsentrasjonen av EV i humant blodplasma er i området 10 10 partikler / ml mens lipoproteiner måles ved 1016 per ml14,34. Selv ved EV-berikelse foreslår studier som sammenligner partikkelpositivitet for tetraspaninmarkører og / eller LDL-markør ApoB ~ 50-100x større overflod av LDL i blodplatefri plasma (PFP) prøver sammenlignet med EV35.
Isoleringsteknikken som brukes påvirker i stor grad rekkevidden av koisolerte ikke-EV-partikler som svært lavdensitetslipoproteiner (VLDL), lipoproteiner med mellomliggende tetthet (IDL) og LDL36. Det er også beskrivelser av lipoprotein-koisolater bundet til elbiler som, selv om de potensielt spiller en viktig biologisk rolle, gjør oppnåelse av EV-rene prøver til et utfordrende mål35.
Derfor kan det argumenteres for at det legges større vekt på beskrivelsen av partikler som utgjør en prøve, i stedet for å oppnå isolasjon av et rent, men begrenset utvalg av elbiler. Å oppnå omfattende beskrivelse av partikler ved å måle tetraspanin overflod i bulk og partikkeltall separat kan være utilstrekkelig for å nøyaktig bestemme EV-konsentrasjoner, spesielt fra biofluidkilder36,37. Identifisering av underpopulasjoner i en tierbasert tilnærming, som viser totale partikler, EV og EV som presenterer visse proteiner, som vist i dette eksperimentet, kan gi en robust løsning på nanopartikkelkarakterisering. Dette har vært tilfelle for prosjekter som involverer EV-lasting med design for fremtidige terapeutiske applikasjoner20 og identifisering av CD63+ elbiler med luminal last som mitokondrier38.
nFCM innenfor repertoaret av EV-analyse
En styrke ved nFCM EV-analyse er måten data kan bekrefte og bygge på de vanligste EV-analysene og danne broer mellom fysiske og fenotypiske datasett. Dette er imidlertid basert på nøyaktige merkingsprotokoller som ofte må optimaliseres for unike merkingsreagenser som fargestoffer og antistoffer. Et nøkkelkriterium for nøyaktig analyse er å ha merkede partikler suspendert i en ikke-fluorescerende buffer, som er avhengig av enten fjerning av overflødig ubundet fluorofor eller forfining av protokoller for ikke å overstige epitopmetning.
Sammenligningsstudier har vist at nFCM-dimensjonering av elbiler gir data i tråd med TRPS og cryo-TEM, teknikker som beskrives som mer nøyaktige enn NTA for EV-størrelsesanalyse10,39. Imidlertid, som med enhver optisk-basert metode, må påvirkningen av heterogene optiske egenskaper sett for elbiler og forskjeller mellom de optiske egenskapene til referansemateriale og elbiler anerkjennes ved tolkning av data10.
Western blotting har vært en viktig metode for å indikere EV-anrikning gjennom identifisering av EV-markører40. Men ønsket om å demonstrere tilstedeværelsen av slike markører på partikler har drevet fremskritt i EV-baserte flowcytometriske analyser17. Imidlertid oppnås de nødvendige oppløsningene for å gi robuste data for tiden best gjennom dedikert instrumentering med hensyn til både spredt og fluorescerende lys19.
nFCM gir en objektiv tilnærming til først å beskrive alle partikler irrelevant for spesifikke markører, ved bruk av sidespredningsmåling, noe som muliggjør bekreftelse med de vanligste teknikkene for NTA, RPS og TEM1, samtidig som fenotypisk måling ligner på WB eller Elisa på en kvantitativ måte.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke gruppene av Owen Davies og Nick Peake for å fortsette å gi materiale og kompetanse.
APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
Memglow – Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |