सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (CARS) मस्तिष्क स्लाइस में इमेजिंग माइलिनेशन के लिए आवेदन
Summary
तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने वाले कई शोधकर्ताओं के लिए माइलिनेशन की कल्पना करना एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है। CARS एक ऐसी तकनीक है जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ संगत है जो मस्तिष्क जैसे ऊतक के भीतर लिपिड को मूल रूप से छवि बना सकती है जो माइलिन जैसी विशेष संरचनाओं को रोशन करती है।
Abstract
सुसंगत स्टोक्स विरोधी रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (CARS) एक तकनीक है जो रसायनज्ञों और भौतिकविदों द्वारा अणुओं के हस्ताक्षर कंपन के सुसंगत संकेत का उत्पादन करने के लिए शास्त्रीय रूप से नियोजित की जाती है। हालांकि, ये कंपन हस्ताक्षर मस्तिष्क जैसे शारीरिक ऊतक के भीतर अणुओं की विशेषता भी हैं, जिससे यह तंत्रिका विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए तेजी से उपयोगी और लागू होता है। उदाहरण के लिए, CARS इन अणुओं के भीतर विशेष रूप से रोमांचक रासायनिक बंधों द्वारा लिपिड को माप सकता है, जिससे ऊतक के विभिन्न पहलुओं की मात्रा का ठहराव हो सकता है, जैसे कि न्यूरोट्रांसमिशन में शामिल माइलिन। इसके अलावा, आमतौर पर माइलिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली अन्य तकनीकों की तुलना में, CARS को इम्यूनोफ्लोरोसेंट तकनीकों के साथ संगत होने के लिए भी स्थापित किया जा सकता है, जिससे सोडियम चैनल या सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के अन्य घटकों जैसे अन्य मार्करों के साथ सह-लेबलिंग की अनुमति मिलती है। माइलिनेशन परिवर्तन मल्टीपल स्केलेरोसिस या अन्य न्यूरोलॉजिकल स्थितियों जैसे फ्रेजाइल एक्स सिंड्रोम या ऑटिज़्म स्पेक्ट्रम विकारजैसी बीमारियों को कम करने में एक स्वाभाविक रूप से महत्वपूर्ण तंत्र है जो अनुसंधान का एक उभरता हुआ क्षेत्र है। निष्कर्ष में, CARS का उपयोग न्यूरोसाइंस में दबाव वाले सवालों के जवाब देने और कई अलग-अलग न्यूरोलॉजिकल स्थितियों से संबंधित अंतर्निहित तंत्र के लिए सबूत प्रदान करने के लिए अभिनव तरीकों से किया जा सकता है।
Introduction
एक्शन पोटेंशिअल मस्तिष्क में सूचना की मूल इकाई है, और अक्षतंतु के माध्यम से कार्रवाई संभावित प्रसार सूचना प्रसंस्करण 1,2,3 का एक स्तंभ बनाता है। न्यूरॉन्स आमतौर पर कई अन्य न्यूरॉन्स से अभिवाही इनपुट प्राप्त करते हैं और इन इनपुट को किसी दिए गए संकीर्ण समय विंडो 4,5 के भीतर एकीकृत करते हैं। इसलिए, अक्षतंतु में कार्रवाई संभावित प्रसार के तंत्र को जांचकर्ताओं से महत्वपूर्ण मात्रा में ध्यान मिला है।
अक्षतंतु के माध्यम से प्रचार करते समय, विश्वसनीय प्रसार सुनिश्चित करने के लिए अक्षतंतु के साथ एक क्रिया क्षमता को बार-बार पुनर्जीवितकिया जाता है। जबड़े वाले कशेरुकी (ग्नाथोस्टोम) के अधिकांश न्यूरॉन्स में अक्षतंतु माइलिन के एक आवरण से घिरे होते हैं, जो पास के ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स या श्वान कोशिकाओं द्वारा निर्मित एक लिपिड युक्त पदार्थ है, जो ग्लियल कोशिकाओं के प्रकार हैं (7,8 में समीक्षा की गई)। यह माइलिन म्यान विद्युत रूप से अक्षतंतु को इन्सुलेट करता है, इसकी धारिता को कम करता है और कार्रवाई संभावित प्रसार को कुशलतापूर्वक, जल्दी से और कम ऊर्जा खपत के साथ अनुमति देता है। माइलिन अक्षतंतु को समान रूप से कवर नहीं करता है, लेकिन यह अक्षतंतु को उन खंडों में ढक देता है जिनके बीच छोटे अंतराल होते हैं, जिन्हें रैनवियर के नोड्स कहा जाता है (9,10 में समीक्षा की गई)। माइलिनेशन मोटाई, जो एक अक्षतंतु के विद्युत इन्सुलेशन के स्तर को नियंत्रित करती है, और रैनवियर के नोड्स की रिक्ति, जो उस आवृत्ति को नियंत्रित करती है जिसके साथ एक अक्षतंतु के साथ कार्रवाई क्षमता पुनर्जीवित होती है, कार्रवाई संभावित प्रसार की गति को प्रभावित करती है (11 में समीक्षा की गई)।
साहित्य का एक बड़ा निकाय यह सुझाव देता है कि माइलिनेशन मोटाई अक्षतंतु 12,13,14 में कार्रवाई संभावित प्रसार की गति को प्रभावित करती है। इसके अलावा, एक्सॉन माइलिनेशन में परिवर्तन के परिणामस्वरूप कई सीएनएस घाटे 15,16,17,18,19,20,21 हो सकते हैं। इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कई शोध प्रयासों के फोकस में एक्सॉन माइलिनेशन का माप और लक्षण वर्णन शामिल है। माइलिन मोटाई का माप आमतौर पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ किया गया है, एक ऐसी तकनीक जिसके लिए ऊतक तैयारी की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयोजन में उपयोग करना चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, एक्सॉन माइलिनेशन को मापने के लिए एक तेज और सरल तकनीक भी है जो सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (CARS) पर आधारित है। एक कार्स लेजर को विभिन्न आवृत्तियों के लिए ट्यून किया जा सकता है और जब लिपिड को उत्तेजित करने के लिए उपयुक्त आवृत्तियों के लिए ट्यून किया जाता है, तो माइलिन को किसी भी अतिरिक्त लेबल22 की आवश्यकता के बिना चित्रित किया जा सकता है। लिपिड इमेजिंग को मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ जोड़ा जा सकता है जैसे कि लिपिड को कई फ्लोरोसेंट चैनलों के साथ चित्रित किया जा सकताहै। CARS के साथ इमेजिंग माइलिनेशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में काफी तेज है और इसमें एक रिज़ॉल्यूशन है, हालांकि ईएम से कम है, एक ही प्रकार के अक्षतंतु में माइलिनेशन में छोटे अंतर का पता लगाने के लिए भी पर्याप्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
साहित्य का एक बढ़ता हुआ शरीर मस्तिष्क समारोह में माइलिन की भूमिका पर जोर देताहै 13,16,21,28। इसके अलावा, हम जानते हैं कि माइलिनेशन मोटाई और माइलिनेशन पैटर्न क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच आर 01 डीसी 17924, आर 01 डीसी 18401 (क्लग), और एनआईएच 1 आर 15एचडी 105231-01, टी 32 डीसी 012280 और एफआरएएक्सए (मैककुलाघ) द्वारा समर्थित। कार्स इमेजिंग को कोलोराडो एनशुट्ज़ मेडिकल कैंपस विश्वविद्यालय में न्यूरोटेक्नोलॉजी सेंटर के उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी कोर भाग में एनआईएच पी 30 एनएस 048154 और एनआईएच पी 30 डीके 116073 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
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