FACS-isolasjon og kultur av fibro-adipogene forfedre og muskelstamceller fra uforstyrret og skadet museskjelettmuskulatur
Summary
Den nøyaktige identifiseringen av fibro-adipogene stamceller (FAPs) og muskelstamceller (MuSCs) er avgjørende for å studere deres biologiske funksjon i fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokollen gir retningslinjer for isolering, rensing og kultur av FAPs og MuSCs fra voksne musemuskler.
Abstract
Fibro-adipogene stamceller (FAPs) er en populasjon av skjelettmuskulaturbosatte mesenkymale stromale celler (MSCs) som er i stand til å differensiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen avstamning. Sammen med muskelstamceller (MuSCs) spiller FAPs en kritisk rolle i muskelhomeostase, reparasjon og regenerering, samtidig som de aktivt opprettholder og ombygger den ekstracellulære matrisen (ECM). Under patologiske forhold, som kronisk skade og muskeldystrofier, gjennomgår FAPs avvikende aktivering og skiller seg ut i kollagenproduserende fibroblaster og adipocytter, noe som fører til fibrose og intramuskulær fettinfiltrasjon. Dermed spiller FAPs en dobbel rolle i muskelregenerering, enten ved å opprettholde MuSC-omsetning og fremme vevsreparasjon eller bidra til fibrotisk arrdannelse og ektopisk fettinfiltrater, noe som kompromitterer integriteten og funksjonen til skjelettmuskelvevet. En riktig rensing av FAPs og MuSCs er en forutsetning for å forstå den biologiske rollen til disse cellene i fysiologiske så vel som under patologiske forhold. Her beskriver vi en standardisert metode for samtidig isolering av FAPs og MuSCs fra lemmuskler hos voksne mus ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Protokollen beskriver i detalj den mekaniske og enzymatiske dissosiasjonen av mononukleerte celler fra hele lemmuskler og skadede tibialis anterior (TA) muskler. FAPs og MuSCs blir deretter isolert ved hjelp av en halvautomatisert cellesorterer for å oppnå rene cellepopulasjoner. Vi beskriver i tillegg en optimalisert metode for dyrking av hvilende og aktiverte FAPs og MuSCs, enten alene eller i kokulturforhold.
Introduction
Skjelettmuskulaturen er det største vevet i kroppen, og står for ~ 40% av voksen menneskelig vekt, og er ansvarlig for å opprettholde holdning, generere bevegelse, regulere basal energimetabolisme og kroppstemperatur1. Skjelettmuskulatur er et svært dynamisk vev og har en bemerkelsesverdig evne til å tilpasse seg en rekke stimuli, for eksempel mekanisk stress, metabolske endringer og daglige miljøfaktorer. I tillegg regenererer skjelettmuskulaturen som svar på akutt skade, noe som fører til fullstendig restaurering av morfologi og funksjoner2. Skjelettmuskulaturens plastisitet er hovedsakelig avhengig av en populasjon av bosatte muskelstamceller (MuSCs), også kalt satellittceller, som ligger mellom myofiberplasmamembranen og basal lamina 2,3. Under normale forhold bor MuSCs i muskelnisjen i hvilemodus, med bare noen få divisjoner for å kompensere for cellulær omsetning og for å fylle opp stamcellebassenget4. Som svar på skade går MuSCs inn i cellesyklusen, sprer seg og bidrar enten til dannelsen av nye muskelfibre eller går tilbake til nisje i en selvfornyelsesprosess 2,3. I tillegg til MuSCs, homeostatisk vedlikehold og regenerering av skjelettmuskulaturen stole på støtte fra en populasjon av muskel bosatt celler kalt fibro-adipogenic forfedre (FAPs) 5,6,7. FAPs er mesenkymale stromale celler innebygd i muskelbindevevet og i stand til å differensiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen avstamning 5,8,9,10. FAPs gir strukturell støtte til MuSCs, da de er en kilde til ekstracellulære matriksproteiner i muskelstamcellenisjen. FAPs fremmer også langsiktig vedlikehold av skjelettmuskulaturen ved å utskille cytokiner og vekstfaktorer som gir trofisk støtte til myogenese og muskelvekst 6,11. Ved akutt muskelskade sprer FAPs seg raskt for å produsere en forbigående nisje som støtter den strukturelle integriteten til den regenererende muskelen og gir et gunstig miljø for å opprettholde MuSCs spredning og differensiering på en parakrin måte5. Etter hvert som regenerering fortsetter, blir FAPs fjernet fra den regenerative muskelen ved apoptose, og deres tall går gradvis tilbake til basalt nivå12. Imidlertid, under forhold som favoriserer kronisk muskelskade, overstyrer FAPs pro-apoptotisk signalering og akkumuleres i muskelnisjen, hvor de skiller seg ut i kollagenproduserende fibroblaster og adipocytter, noe som fører til ektopiske fettinfiltrater og fibrotisk arrdannelse12,13.
På grunn av deres multipotens og deres regenerative evner, har FAPs og MuSCs blitt identifisert som potensielle mål i regenerativ medisin for behandling av skjelettmuskulaturforstyrrelser. Derfor, for å undersøke deres funksjon og terapeutiske potensial, er det viktig å etablere effektive og reproduserbare protokoller for isolasjon og kultur av FAPs og MuSCs.
Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan identifisere forskjellige cellepopulasjoner basert på morfologiske egenskaper som størrelse og granularitet, og tillater cellespesifikk isolasjon basert på bruk av antistoffer rettet mot celleoverflatemarkører. Hos voksne mus uttrykker MuSCs det vaskulære celleadhesjonsmolekylet 1 (VCAM-1, også kjent som CD106) 14,15 og α7-Integrin15, mens FAPs uttrykker blodplateavledet vekstfaktorreseptor α (PDGFRα) og stamcelleantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . I protokollen beskrevet her ble MuSCs identifisert som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mens FAPs ble identifisert som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt ble PDGFRαEGFP-mus brukt til å isolere FAPer som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-hendelser18,19. Videre sammenlignet vi overlappingen mellom det fluorescerende signalet til PDGFRα-GFP + -celler til celler identifisert av overflatemarkøren Sca1. Vår analyse viste at alle GFP-uttrykkende celler også var positive for Sca1, noe som indikerer at begge tilnærmingene kan brukes til identifisering og isolering av FAPs. Til slutt bekreftet farging med spesifikke markørantistoffer renheten til hver cellepopulasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etablering av effektive og reproduserbare protokoller for identifisering og isolering av rene voksne stamcellepopulasjoner er det første og mest kritiske skrittet mot å forstå deres funksjon. Isolerte FAPs og MuSCs kan brukes til å gjennomføre multiomics analyse i transplantasjonseksperimenter som en potensiell behandling for muskelsykdommer eller kan genmodifiseres for sykdomsmodellering i stamcelleterapi.
Protokollen beskrevet her gir standardiserte retningslinjer for identifisering, i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) for råd om MuSC-isolasjon. Dette arbeidet ble finansiert av NIAMS-IRP gjennom NIH-tilskudd AR041126 og AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referências
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Biologia do Desenvolvimento. 326 (1), 47-59 (2009).
