En vävnadsrensningsmetod för neuronal avbildning från mesoskopiska till mikroskopiska skalor
Summary
Protokollet ger en detaljerad metod för neuronal avbildning i hjärnskiva med hjälp av en vävnadsrensningsmetod, ScaleSF. Protokollet inkluderar beredning av hjärnvävnad, vävnadsförtydligande, hantering av rensade skivor och konfokal laserskanningsmikroskopiavbildning av neuronala strukturer från mesoskopiska till mikroskopiska nivåer.
Abstract
Ett detaljerat protokoll tillhandahålls här för att visualisera neuronala strukturer från mesoskopiska till mikroskopiska nivåer i hjärnvävnader. Neuronala strukturer som sträcker sig från neurala kretsar till subcellulära neuronala strukturer visualiseras i mushjärnskivor optiskt rensade med ScaleSF. Denna clearingmetod är en modifierad version av ScaleS och är en hydrofil vävnadsrensningsmetod för vävnadsskivor som uppnår potent röjningsförmåga samt en hög grad av bevarande av fluorescenssignaler och strukturell integritet. En anpassningsbar tredimensionell (3D) tryckt bildkammare är utformad för tillförlitlig montering av rensade hjärnvävnader. Mushjärnor injicerade med en adenoassocierad virusvektor som bär förbättrad grön fluorescerande proteingen fixerades med 4% paraformaldehyd och skars i skivor med 1 mm tjocklek med en vibrerande vävnadsskivare. Hjärnskivorna rensades genom att följa clearingprotokollet, som inkluderar sekventiella inkubationer i tre lösningar, nämligen ScaleS0-lösning, fosfatbuffertsaltlösning (–) och ScaleS4-lösning, i totalt 10,5–14,5 timmar. De rensade hjärnskivorna monterades på bildkammaren och inbäddades i 1,5% agarosgel upplöst i ScaleS4D25(0)-lösning. 3D-bildinhämtningen av skivorna utfördes med hjälp av ett konfokalt laserscanningsmikroskop utrustat med en objektivlins med flera nedsänkningar med långt arbetsavstånd. Från och med mesoskopisk neuronal avbildning lyckades vi visualisera fina subcellulära neuronala strukturer, såsom dendritiska ryggar och axonala boutoner, i de optiskt rensade hjärnskivorna. Detta protokoll skulle underlätta förståelsen av neuronala strukturer från krets till subcellulära komponentskalor.
Introduction
Vävnadsrensningsmetoder har förbättrat djupoberoende avbildning av biologiska och kliniska prover med ljusmikroskopi, vilket möjliggör extraktion av strukturell information på intakta vävnader 1,2. Optiska röjningstekniker kan också potentiellt påskynda och minska kostnaden för histologisk analys. För närvarande finns tre huvudsakliga clearingmetoder tillgängliga: hydrofila, hydrofoba och hydrogelbaserade metoder 1,2. Hydrofila tillvägagångssätt överträffar när det gäller att bevara fluorescenssignaler och vävnadsintegritet och är mindre giftiga jämfört med de andra två tillvägagångssätten 3,4.
En hydrofil röjningsmetod, ScaleS, har en särställning med sitt bevarande av strukturell och molekylär integritet samt potent röjningsförmåga (clearing-bevarandespektrum)5. I en tidigare studie utvecklade vi ett snabbt och isometriskt clearingprotokoll, ScaleSF, för vävnadsskivor (~1 mm tjocklek) genom att modifiera röjningsproceduren för ScaleS6. Detta clearingprotokoll kräver sekventiella inkubationer av hjärnskivor i tre lösningar för 10,5-14,5 h. Metoden har ett högt clearing-bevarandespektrum, vilket är kompatibelt även med elektronmikroskopi (EM) -analys (kompletterande figur 1), vilket möjliggör flerskalig högupplöst tredimensionell (3D) avbildning med exakt signalrekonstruktion6. Således bör ScaleSF vara effektiv särskilt i hjärnan, där neuronala celler utarbetar sprudlande processer av enorm längd och ordnar specialiserade fina subcellulära strukturer för överföring och mottagning av information. Att extrahera strukturell information med skalor från krets till subcellulära nivåer på neuronala celler är ganska användbart för bättre förståelse av hjärnans funktioner.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att visualisera neuronala strukturer med skalor från den mesoskopiska / kretsen till mikroskopisk / subcellulär nivå med ScaleSF. Protokollet inkluderar vävnadsberedning, vävnadsförtydligande, hantering av rensade vävnader och konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) avbildning av rensade vävnader. Vårt protokoll fokuserar på att förhöra neuronala strukturer från krets till subcellulära komponentskalor. För en detaljerad procedur för beredning av lösningarna och stereotaxisk injektion av adenoassocierade virusvektorer (AAV) i mushjärnor, se Miyawaki et al.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg inom protokollet
Det finns några kritiska steg i protokollet som bör genomföras med största försiktighet för att få meningsfulla resultat. Enhetlig fixering av prover är absolut nödvändigt för 3D-avbildning i storskaliga vävnader. Objektivlinsen, provet och nedsänkningsvätskan ska ha matchande RI. RI-missmatchning bland dem kommer att leda till mycket störd avbildning av EGFP-uttryckande celler i de rensade hjärnskivorna (figur 3). Korrigeringskragens jus…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Yoko Ishida (Juntendo University) för AAV-vektorproduktion och Kisara Hoshino (Juntendo University) för tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av JSPS KAKENHI (JP20K07231 till K.Y.; JP21H03529 till T.F.; JP20K07743 till M.K.; JP21H02592 till H.H.) och vetenskaplig forskning om innovativt område “Resonansbio” (JP18H04743 till H.H.). Denna studie stöddes också av Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 till T.F. och H.H.), Moonshot R&D från Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 till H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) från JST (JPMJFR204D till H.H.), Grants-in-Aid från Research Institute for Diseases of Old Age vid Juntendo University School of Medicine (X2016 till K.Y.; X2001 till H.H.) och Private School Branding Project.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
Referências
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
